[发明专利]基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学领域，特别涉及基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法。

背景技术

鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病，在世界各养鸭地区都有分布，其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法主要有中和试验(neutralization test，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法和被动血凝试验。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DPV感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段；但是，由于DPV全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA)的大规模应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的鸭瘟病毒抗体检测方法，该方法避免了繁琐的病毒纯化步骤，且操作简单，特异性、灵敏性较高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，具体步骤为：

a固相抗原的制备：将包被浓度大于或等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

b一抗结合：将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

c二抗结合：将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；

d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

e检测及结果判定：将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD_450nm值，当OD_450nm值＞0.216时判为阳性，当OD_450nm≤0.216时判为阴性。

进一步，所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于，具体步骤为：

a固相抗原的制备：将包被浓度等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

b一抗结合：将待检血清作等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

c二抗结合：将酶标二抗作等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；

d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

e检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD_450nm值，所述OD_450nm值＞0.216为阳性，所述OD_450nm≤0.216则为阴性；

进一步，步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μL；

进一步，步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP；

进一步，步骤a中所述的封闭液为体积百分浓度为1％的牛血清白蛋白溶液；

进一步，步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺；

进一步，步骤d中避光显色的时间为20分钟；

进一步，所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。

本发明的有益效果在于：本发明基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)和鸭大肠杆菌(E.coli)的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法对批内或批间重复试验显示变异系数均小于10％，能检出经1∶3200倍稀释的DPV阳性血清。

附图说明