[发明专利]添加达托霉素合成关键酶辅因子提高达托霉素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及添加达托霉素合成关键酶辅因子以提高达托霉素产量的方法。

背景技术

病原菌对抗生素的普遍耐药性，是全球面临的严峻挑战，每年都有成百上千耐药病原菌株出现。万古霉素曾经被公认为抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，现在在国内外已经发现了很多该药的抗性菌株。因此开发一种具有新型作用机理的能有效抑制耐药性病原菌的新型抗生素，迫在眉睫。

“玫瑰孢链霉菌”(拉丁名称为：“Streptomyces roseosporus”)是一种链霉菌属的放线菌，其生长指数增长后期到稳定期合成的达托霉素(英文名“daptomycin”)为N-癸酰朙-色氨酰朙-天冬酰胺酰朙-天冬氨酰朙-苏氨酰甘氨酰朙-鸟氨酰朙-D-天冬氨酰朌-丙氨酰朙-天冬氨酰甘氨酰朌-丝氨酰杢hreo-3-甲基朙-谷氨酰？-丙氨酸ε1-内酯，是由一个十碳烷侧链与一个环状β氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成，是一种大环内酯类新型抗生素。

达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂质(LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理，对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著的治疗效果。

2003年，达托霉素(Daptomycin，LY146032)成为第一个被美国FDA批准上市的首个脂肽类抗生素。2006年1月，达托霉素再次获得了欧洲药品评价署(EMEA)在整个欧洲的认证，从此它更加由于其能够从多个方面破坏细胞膜功能，并迅速杀死革兰氏阳性菌确切疗效引起了人们普遍关注。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但是没有经过发酵优化，特别是没有添加达托霉素合成关键酶辅因子的，达托霉素的产量低，生产成本很高。

在培养基添加优化的辅因子在发酵工艺优化技术中应用较广，其作用于相应的目的代谢产物的合成途径中的关键酶，显著提高酶活，将代谢流更多的导向目的代谢产物。刘立明等利用添加优化组合的浓度的硫酰氨(VB1)和生物素使代谢流从丙酮酸更多流向三羧酸循环，使α-酮戊二酸得到极大的积累，浓度达到43.7g/L。李正军等将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)激酶在大肠杆菌中过表达，以提高NADPH在胞内水平，使聚三羟基丁酸(PHB)的产量从7g/L提高到14g/L。而把辅因子用在达托霉素发酵培养基优化方面，还未见有相关文献和报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种添加优化浓度的关键酶辅因子以提高达托霉素的产量，依此法可以有效的提高达托霉素的产量。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明的一种在发酵培养基中添加达托霉素合成关键酶辅因子提高达托霉素产量的方法，在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；然后用0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，28℃～32℃，180～220rpm摇床中培养48小时；然后以1％的接种量，加到装有发酵培养基的自动7.5LDE发酵罐中；添加0.5～30毫克每升的辅因子亚铁血红素或甲酰四氢叶酸或吡哆醛磷酸VB6的一种或其组合；在28℃～32℃，通气量控制0.8～1.2v/v/m，pH6.5～7.5发酵90～144小时。

所述的种子液体培养基组成及质量含量为：糊精1～1.5g，葡萄糖0.2～0.5g，蛋白胨0.3～0.5g，酵母浸粉0.2～0.5g，K₂HPO₄·3H₂O0.01～0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05，CaCO₃ 0.01～0.02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH 7.5。