[发明专利]ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的抗体及其制备方法，具体是一种ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

UDP-半乳糖酰胺：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-Ts)是O-型糖蛋白糖链合成反应的第一步起始糖基转移酶，它能将N-乙酰氨基半乳糖基转移到蛋白质肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上。人体中的ppGalNAc-Ts家族中己有19个成员被报道研究，它们在人体组织中的分布和对体外多肽底物的糖基化修饰的专一性上都存在着不同程度的差异。ppGalNAc-Ts可作为肿瘤标志物，例如在神经母细胞瘤衍生细胞株中特异性高表达的ppGalNAc-T13，它可以作为脊髓发生神经母细胞瘤的早期诊断标志。另外，ppGalNAc-T6可以作为乳腺癌的免疫组化检测标志。最新研究结果表明，ppGalNAc-T14调控死亡受体Apo2L/TRAIL的糖基化修饰，过表达ppGalNAc-T14能显著促进细胞的凋亡。ppGalNAc-Ts除具有糖基转移酶功能之外，还具有潜在的重要临床诊断意义。因此，获得ppGalNAc-Ts家族各个成员的抗体，对精确定位其在组织和细胞中的分布有着重要意义，从而更真实的反映它们的生物学功能。然而ppGalNAc-Ts家族成员间的同源性较高，不同成员间的同源性可达40％～70％，因此保证其抗体的特异性至关重要。

ppGalNAc-Ts家族成员均为II型膜蛋白，N端有一个4～22个氨基酸的胞浆区，继以一个15～25个氨基酸的穿膜区，通过一个长短不一的茎区与C端伸入高尔基体内大约450个氨基酸的催化区相连接。ppGalNAc-T20从一级结构分析属于UDP-半乳糖酰胺：多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员，它与ppGalNac-T10在氨基酸水平上具有70.7％的相似性。虽然只在脑和睾丸组织中检测到表达量较低的ppGalNAc-T20mRNA，但鉴于其存在部位的特殊性，可以推测其在机体分化、发育过程中起着重要的调节作用。

经对现有技术的文献检索发现，N Berois et al.等采用多肽合成的方法制备ppGalNAc-T13抗体(N Berois et al.，ppGalNAc-T13：A New Molecular Marker of BoneMarrow Involvement in Neuroblastoma，Clinical Chemistry，2006，52：1701～1712)，该方法一般需要合成15个左右的肽段，这样比较容易保证抗体的特异性。但是，由于多肽的分子量相对较小，免疫原性较差，得到抗体比较困难，通常需将其与MAP(multipleantigenic peptide)或KLH(钥孔血蓝蛋白)偶联，但是这样提高了成本。一般用来制备抗体的抗原肽需10～20mg，纯度85％以上，这种级别的多肽合成价格为120元/氨基酸，偶联基团MAP的价格也在1000元以上，较低的免疫原性和高昂的成本，限制了合成多肽用于抗体制备方法的应用。目前尚未有与ppGalNAc-T20抗体制备相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法。本发明制备的抗体不和与ppGalNAc-T20具有最高同源性的ppGalNAc-T10发生交叉反应，更不与ppGalNAc-Ts家族其它成员发生交叉反应；本发明通过简单的分子克隆实验制备出所需的抗原蛋白，且该抗原蛋白与GST融合表达，易于纯化；本发明克服了合成多肽方法免疫原性差、价格昂贵等缺点。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明涉及一种ppGalNAc-T20抗原，该抗原为蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

编码所述蛋白质的核酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还涉及一种如上所述的ppGalNAc-T20抗原的多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

步骤一，以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；

步骤二，纯化抗血清，即得。

本发明还涉及一种如上所述的ppGalNAc-T20抗原的多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

步骤一，克隆如SEQ ID NO：1所示的核酸片段；

步骤二，利用步骤一所得核酸片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得蛋白质；

步骤三，以步骤二所得蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，即得。