[发明专利]野生茄子耐盐基因StNHXl植物表达载体

说明书

一、技术领域

本发明涉及了野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因Na⁺/H⁺反向转运体(StNHX1)植物表达载体的构建，属于分子生物学和生物技术领域。 

二、背景技术

土壤盐渍化是一个世界性难题，全世界盐渍化土面积约10亿公顷；我国盐渍土面积约3,460万公顷，耕地盐碱化760万公顷，近1/5耕地发生盐渍化，其中原生盐化型、次生盐化型和各种碱化型分布分别占总面积的52％、40％和8％。 

盐对于植物的毒害作用主要是由于水分亏缺导致的渗透胁迫以及过量的Na⁺对重要生化过程的毒害。植物克服盐胁迫的机制是Na⁺的外排和液泡区室化。质膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白利用质膜H⁺-ATPase产生的跨膜质子梯度将Na⁺排出细胞，减少Na⁺向叶片中的长距离转运而保护光合组织免受盐的毒害。液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白则利用液泡膜质子泵(H⁺-ATPase和H⁺-PPase)产生的跨膜质子梯度将Na⁺区室化进入液泡，不仅减轻了过多Na⁺的累积对细胞质的毒害，而且可以利用NaCl作为溶质维持渗透势以驱动水分进入细胞。因此，Na⁺/H⁺反向转运蛋白在植物耐盐性中发挥着重要作用. 

三、发明内容

技术问题：本发明涉及野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因Na⁺/H⁺反向转运体(StNHX1)植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。构建的植物表达载体导入农作物，可增强其耐盐性。 

技术方案： 

野生茄子‘Torvum Vigor’耐盐基因Na⁺/H⁺反向转运体植物表达载体的构建： 

1)野生茄子‘Torvum Vigor’中StNHX1耐盐基因的克隆： 

以野生茄子‘Torvum Vigor’(为日本砧木品种，购自日本Takii种苗株式会社)幼嫩叶片为材料，提取叶片总RNA，取2μg总RNA反转录cDNA。根据番茄中耐盐基因NHX1(Venema K，Belver A，Marin-Manzano M C，Rodriguez-Rosales M P，Donaire J P.A novel intracellular K⁺/H⁺antiporter related to Na⁺/H⁺antiporters is important for K⁺ionhomeostasis in plants.J.Biol.Chem.2003，278(25)：22453-22459)的序列(AccessNO.：AJ306630.1)设计引物，在‘Torvum Vigor’叶片cDNA中扩增耐盐基因StNHX1： 

上游引物F：5’-GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG-3’ 

下游引物R：5’-CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC-3’ 

将PCR产物(1599bp)连接到pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)上，命名为 pMD19-StNHX1，测序验证； 

2)StNHX1基因连接至pBI121质粒： 

BamHI/Sac I双酶切质粒pMD19-StNHX1回收StNHX1片段，同样双酶切pBI121质粒(购自上海希匹吉生物技术有限公司)回收pBI121-GUS^-(12947bp)；将回收的两片段用T₄连接酶连接，命名为p121-GUS^--StNHX1，转化DH5α感受态细胞，后续试验备用； 

3)StNHX1基因连接至pCAMBIA1301质粒构建植物表达载体：