[发明专利]一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法

说明书

技术领域

一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法，具体的说是一种枯草芽孢杆菌株，以及利用该菌株发酵生产凝乳酶的方法。本发明属于微生物发酵技术领域。 

背景技术

凝乳酶是乳酪生产中的关键酶，它使原奶凝固分为两个阶段：酪蛋白微胶粒中α-酪蛋白和β-酪蛋白在κ-酪蛋白作用下不会发生自发凝结，首先凝乳酶专一性的将κ-酪蛋白分解为p-κ-酪蛋白和一种巨肽，使酪蛋白的微胶粒失去稳定性；然后在Ca²⁺作用下p-κ-酪蛋白及α-酪蛋白和β-酪蛋白之间形成化学键从而形成沉淀。 

凝乳酶传统上利用牛犊第四胃(皱胃)提取制作，随着乳酪产业不断扩大，单纯靠宰杀幼畜的方法来生产凝乳酶已经不能满足现代工业对凝乳酶的需求。上世纪五十年代以来，研究者一直努力寻求新的凝乳酶来源，目前除动物凝乳酶外，还有植物凝乳酶(无花果树液和菠萝果实)和微生物凝乳酶(主要来源于真菌)。微生物的生长特性使得微生物凝乳酶具有广阔的发展前景，关于微生物凝乳酶的研究主要集中在霉菌如米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucor pusillus)的固态发酵产酶方面，而关于细菌液态发酵的研究报道较少。 

与霉菌固体发酵相比，细菌液体发酵生产凝乳酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。但是，细菌生产的凝乳酶活性和霉菌相比，还具有一定的差距。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高产凝乳酶活性的枯草芽孢杆菌菌株，以及利用该菌株液体发酵生产凝乳酶的方法。 

本发明的技术方案：一株产凝乳酶的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010259。 

用所述的枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259发酵生产凝乳酶的方法，通过以下步骤实现： (1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259接种于斜面培养基上，在33℃下培养24小时；(2)种子培养：将斜面长好的菌种接入种子培养基中，在33℃培养18小时，摇床转速150转/分钟；(3)液体发酵培养：将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为体积百分比0.1％～0.2％，在32～36℃培养96～136小时，摇床转速150转/分钟；发酵培养基组成，单位为克/升：葡萄糖0～20，麸皮15～30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌30min。 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CCTCC NO：M 2010259筛选、分离与鉴定详见实施例1。 

上述技术方案中所述的斜面培养基为(单位为克/升)：葡萄糖20，酵母膏10，琼脂20，用自来水配制，pH自然，115℃灭菌20min。 

上述技术方案中所述的种子培养基为(单位为克/升)：麸皮30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌30min。 

凝乳酶活力的测定：用0.01mol/L氯化钙溶液配制质量浓度12％脱脂奶粉溶液，室温放置40min后使用，当天配制。取5mL 12％的脱脂奶粉溶液在35℃水浴锅中保温10min，加适量35℃预热10min的酶液(发酵液5000rpm离心5min获得之清液)，立即摇匀，开始计时，把试管倾斜45°，旋转试管，观察壁上出现絮状沉淀时为凝乳终点，记录凝乳时间。40min凝固1mL脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhlet Unit，SU)。 

本发明的有益效果：枯草芽孢杆菌是常见的非致病菌，适合凝乳酶的生产；利用枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶具有产酶水平高，生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件，酶提取方便等诸多优点，完全具有工业化生产的潜力。 

生物材料样品保藏：一株产凝乳酶的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T，该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏日期 2010年9月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2010259。 

具体实施方式

在下面所述的所有具体实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。