[发明专利]表达Asia I型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法

说明书

所属技术领域 本发明涉及牛、羊和猪对布鲁氏菌病和口蹄疫两种传染病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。 

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。 

布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。 

布鲁氏菌存在光滑型(S)和粗糙型(R)两类不同表型的菌株，在凝集类抗体水平上无交叉反应，因此用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗株和野毒株。最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过人工诱变的方法获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但目前该菌株在基因水平与原始菌株之间的的区别尚为完全弄清楚。 

已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。本发明人所在实验室曾构建了wbkC和wboA基因缺失的重组布鲁氏菌疫苗株，并比较了它们之间的免疫效果。其后，又进一步构建了wboA基因不完全缺失株，系统地研究了wboA基因的不同缺失对重组菌的存活率、免疫保护性以及粗糙型表型等方面的特性，并最终确定了wboA基因1-897之间的片段为缺失的靶片段。 

口蹄疫(FMD)是口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度传染性疫病，其特征是在口、舌、唇、鼻、蹄、乳房发生水泡，并溃烂形成烂，严重影响畜牧业发展。该病毒同时可以感染人并形成相似的症状，由于其严重的危害性世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类第一位烈性传染病。世界上绝大多数国家都流行过口蹄疫，但目前本病仅在亚洲部分国家和地区、非洲、中东和南美呈地方性流行或零星散发。已消灭口蹄疫的国家和地区常有重新暴发本病的例证。我国口蹄疫的发病也比较普遍，在我国曾经流行的主要有Asia I型、O型以及A型，近几年来Asia I型和O型流行较为普遍。 

疫苗是控制口蹄疫的重要手段之一，目前我国市场上使用的口蹄疫疫苗有2种，即灭活疫苗和亚单位苗。灭活疫苗在我国已经使用了几十年，而FMD流行的不断严重的现状已经表明了其免疫效果的缺陷性。亚单位疫苗是近几年刚刚被批准使用的一种疫苗，其原理是通过化学方法，合成了FMDV病毒免疫保护性单位VP1的部分氨基酸(约二十多个)的乳化产物作为疫苗，其实质类似于灭活疫苗，主要介导B细胞免疫反应，其免疫保护效果仍在探索之中。作为侵入宿主细胞的病毒性疾病，FMD活苗由于能刺激机体的细胞免疫而达到令人满意的免疫效果，一度被世界各国广泛使用，但后来发现口蹄疫弱毒疫苗易出现毒力返强，因此从上世纪70年代已经停止使用活疫苗。活疫苗免疫所获得的保护效果提示FMD的免疫最好能通过刺激机体的T细胞免疫来实现。 

由于布鲁氏菌感染动物后能够在宿主细胞中长时间存在，强毒布鲁氏菌能被宿主终身携带，布鲁氏菌疫苗株免疫动物后一般能在体内存活1～3周，能够充分介导宿主的T细胞免疫，弥补FMDV灭活疫苗的不足。另一方面，布鲁氏菌和FMDV感染的主要宿主均为猪、牛、羊。因此，表达FMDV的免疫保护基因的布鲁氏菌载体疫苗，将是同时解决布病和口蹄疫免疫防疫的有效手段。 

本发明的目的是通过基因同源重组和蔗糖敏感基因的负筛选技术，构建获得既能表达Asia I型FMDV VP1基因，又不干扰布病临床检测的重组布鲁氏菌，以该重组菌制备的疫苗实现对布鲁氏菌病和Asia I型FMD的双重免疫。 

发明内容