[发明专利]一种抗HPV的抗体、其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域。更具体而言，本发明涉及一种用于预防或治疗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染相关疾病(例如宫颈病变，特别是宫颈癌)的抗体。本发明还涉及所述抗体的制备方法和应用。

背景技术

目前的研究表明，HPV感染与宫颈系统疾病——特别是宫颈癌——的发生有明显的相关性。1995年，国际癌症研究中心(International Agency for Research of Cancer，IARC)公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌等宫颈系统疾病均有密切的因果关系：在99.8％的宫颈癌患者中可检测出HPV感染，而HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌；另外，98％以上的宫颈疾病患者中均可检测出HPV。

HPV病毒根据L1基因的序列同源性可分为不同的型和亚型，同源性在90％以上的为一个型，而同源性在90～98％之间的HPV又可划分为不同的亚型。根据HPV的型别或亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高危型。低危型HPV，例如HPV 6、11、34、40、42等型别多见于良性宫颈病变，如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中则以HPV 16、18、31、33、35、39、45型感染更为多见，这些型为高危型HPV。

针对不同人群的一系列研究已证实生殖道的HPV 16、18型感染与宫颈上皮重度病变(CIN I/CINII)宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。据世界卫生组织(WHO)公布的《世界范围内HPV和宫颈癌2007报告》结果，我国妇女中58.7％的子宫颈癌与HPV16型直接相关。

HPV16E7基因在宫颈癌中持续存在并高表达，在宫颈癌的形成和恶性性状的维持中起重要作用。HPV16E7蛋白共98个氨基酸，其序列如下：MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。该蛋白有三个保守区(conserved region，CR)：CR1位于N端，CR2含有LXCXE结构域，CR3含两个锌指样结构域。E7的中心功能就是通过三个保守区域之一与Rb蛋白家族(如PRb、P107、P130)结合并通过泛素-26S蛋白酶体途径降解Rb家族蛋白。Rb蛋白家族处于细胞周期G1/S关卡的中心环节。在去磷酸化状态下Rb蛋白结合转录因子E2f蛋白，阻止E2f蛋白激活众多与DNA复制有关的蛋白因子，从而抑制DNA合成和细胞周期进展，使细胞处于G0/G1期和进行细胞分化。E7蛋白结合并降解Rb蛋白，释放E2f蛋白，从而激活许多相关的DNA合成蛋白因子，加快DNA复制和细胞的分裂增殖，促进细胞的分化。此外，E7蛋白还能结合细胞周期素A、细胞周期素E、P48等10多种其他蛋白，提高外源性DNA整合和细胞基因突变性等等，加速细胞的转化。

因此，HPV16E7蛋白是宫颈癌肿瘤细胞特异性表达的抗原，是肿瘤细胞区别于正常细胞在胞内表达的抗原靶标。由于是在胞内进行表达的抗原，到细胞表面必须通过抗原提呈的过程。抗原提呈细胞(比如树突状细胞，巨噬细胞)摄取相应抗原，经加工处理后，将抗原降解成8-10个氨基酸的短肽，这些短肽在高尔基体中和MHC-I类分子结合，然后通过胞膜循环展示在细胞表面。这个过程就称为抗原提呈。提呈在细胞表面的MHC-I分子和短肽(称为T细胞表位)，被T细胞识别，从而激活T细胞下游的免疫反应。早期对HPV16 E7抗原的研究表明HPV16E7有三个高亲和力的T细胞表位，分别是第11-20位氨基酸残基：YMLDLQPETT，第49-57位氨基酸残基RAHYNIVTF(SEQ ID NO：5，下称“49-57肽”)和第86-93位氨基酸残基：TLGIVCPI(下称“86-93肽”)。

一般，抗原的T细胞表位只有8-10个氨基酸。而单克隆抗体的可变区有三个CDR(互补决定簇，complementary-determining region)区，大约每个CDR区可识别10个氨基酸左右，单克隆抗体除了亲和结合特定的T细胞表位外，还要识别其它表位，因此，只识别抗原的特定T细胞表位的单克隆抗体难以获得。具体体现在在使用经典的小鼠体内单抗筛选中，用8-10个氨基酸的短肽单独去免疫动物，很难产生抗体。