[发明专利]高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建及使用方法

权利要求书

1.一种高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建，其特征是：首先人工合成一骨骼肌特异启动子SP序列、采用RT-PCR方法从猪的骨骼肌组织中扩增MyoD1基因全长CDs序列；设计融合引物、利用重叠PCR扩增方法获得启动子SP和pMyoD1的融合基因序列，T/A克隆到pMD18-T载体中，双酶切后将融合基因亚克隆入以真核表达绿色荧光蛋白为标记的逆转录病毒PLEGFP-N1载体，构建PLEGFP-N1-spMyoD1双启动子高效表达载体，经限制性内切酶鉴定并测序；用脂质体法转染293T细胞系包装、扩增，对病毒滴度和感染效率进行监测。

2.根据权利要求1所述的一种高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建，其特征是：

a、引物设计

根据猪MyoD1基因mRNA序列Accession No.NM_001002824，应用Primer Premier5.0，DNAClub和Oligo 6.0设计特异性引物P1和P2，扩增长度为960bp；

上游引物P1

5′-ATGGAGCTGCTGTCGCCACCGCTC-3′；

下游引物P2

5′-GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3′；

b、PCR扩增的反应条件

用引物P1和P2从RT-PCR产物cDNA扩增长度为1bp～960bp的编码区序列；反应程序是95℃预变性5min，进入循环95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸2min，循环总数：30circles；最后延伸72℃4min；

c、骨骼肌组织特异性高效表达启动子SP的合成

老鼠染色体1和2基因组的部分5`侧翼调控区的保守序列Accession No.NT_039170、NW_001030694、NW_001030671和鸡骨骼肌组织α-actin基因的顺式作用调控与转录控制区核心序列Accession No.M13631，优化并合成了骨骼肌组织特异性高效表达启动子SP序列，启动子SP序列；在其3`末端人工接一长为24bp的寡聚核苷酸接头；

接头序列5′-TACCTCGACGACAGCGGTGGCGAG-3′；

d、SP与pMyoD1融合基因的重叠PCR扩增

根据已合成的带接头的SP启动子序列和扩增到的pMyoD1基因cDNA序列，应用PrimerPremier5.0和Oligo 6.0设计特异性融合引物P3和P4，扩增长度为1240bp；

在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6.0引物设计时，上下游引物全长输入；上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基的负数值+1下游引物位点的确定为，下游引物-酶切位点-保护性碱基＝A，序列全长-A+1＝下游引物位点；引物设计时候要考虑到序列的起始碱基和末尾碱基中是否包含起始密码子ATG和终止密码子TAA，如果有，要考虑是否需要删除或者保留；引物长度的选择要考虑到CG比例，前面适当加碱基调节GAC比例，5’端照抄；3’端反向互补；保护性碱基和酶切位点加在引物前面；自身互补，二聚体两个引物之间＜6，负数值越大能量越大，退火温度越高，错配几率越小；

上游融合引物P3

5′-GACCTCGAGCACCATTCCTCACGACACCCA-3′；

下游融合引物P4

5′-GTCGGATCCTCAGAGCACCTGGTAGATAGG-3′；

为下一步克隆需要，分别在上、下游引物中引入Xho I和BamH I酶切位点；

重叠PCR扩增重叠PCR反应体系；反应程序95℃预变性3min，进入循环：94℃变形30s，53℃退火45s，72℃延伸3min，循环总数30circles；最后延伸72℃5min；PCR反应产物在1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，并照相记录，最后切胶回收纯化含有SP启动子的融合MyoD1基因cDNA；

e、spMyoD1融合基因的克隆

spMyoD1基因连接到pMD18T-Simple载体。连接体系；连接条件16℃，5h，然后涂板、挑克隆、培养加Amp；将spMyoD1基因连接到pMD18T-Simple载体的菌种进行测序，菌种记作pMD-spMyoD1；

f、逆转录病毒PLEGFP-N1-spMyoD1表达载体构建

用BamH I和Xho I进行亚克隆，将spMyoD1基因从pMD-spMyoD1用XhoI、BamH I酶切下来，亚克隆到同样用这两种内切酶切酶过的PLEGFP-N1载体上，记作为PLEGFP-N1-spMyoD1，spMyoD1与PLEGFP-N1片段载体连接；

g、纯质粒的提取

取1ul质粒加入到9ul的无菌水中，把10ul的混合液加到100ul的DH5α感受态中，DH5α感受态从负80度冰箱取出，冰上溶解，加入后冰上放置30分钟，42度水浴45秒后放入冰上1分钟，加入890ul的LB培养基，37度摇床200转培养一个小时，取200ul培养菌涂布到含抗生素的LB平板上，37度倒置培养16-18小时，挑取菌落到500ul含抗生素的培养基中12小时以上培养，24小时后吸取培养液200ul到2ml的含抗生素的LB培养基中继续12小时以上培养，吸取2ml培养菌，按照超纯质粒提取试剂盒中方法进行质粒提取；

h、细胞复苏

从液氮中取出一支冻存的293T细胞，快速的在37℃水浴锅中溶解，把293T细胞吸到装有10ml的培养液的50ml的离心管中，1500rpm离心5分钟，倒掉废液，加入2ml的培养基，温和晃均匀，把2ml的细胞悬液加到6孔板中的一个孔里，放入37度二氧化碳培养箱中培养48小时，根据细胞情况进行消化传代；

细胞长满90％时可以传代，用37℃预热的PBS洗两遍，加入200ul的0.25％的胰酶消化，细胞变形后10秒加入2ml的培养基，反复吹打，倒置显微镜下观察细胞成单个，停止吹打，把2ml悬液吸到50ml的离心管中，1500rpm离心5分钟，倒掉废液，加入4ml的培养基，温和晃均匀，把每2ml的细胞悬液加到6孔板中的一个孔里，放入37℃CO₂培养箱中培养48小时，根据细胞情况进行消化传代；

j、细胞转染方法

贴壁细胞，转染前一天，每孔细胞长到50％的时候，细胞加2ml的无抗生素DMEM+10％胎牛血清培养基培养，细胞长到80％-90％，可以开始转染；

取20ng/ul的质粒DNA 30ul加到在Opti-MEM 220ul无血清培养基，总体积250ul，轻轻混合。放置5分钟；

用脂质体2000转染293T细胞

(1)取脂质体200010ul，加到在Opti-MEM 240ul无血清培养基，总体积250ul，轻轻混合。放置5分钟；

(2)把脂质体混合液加到DNA混合液中，轻轻混合；放置20分钟；

(3)每20分钟内细胞换液，加入1.5ml的无抗生素的培养基DMEM+10％胎牛血清，把脂质体和DNA的混合液共500ul，逐滴加到6孔板中的一个孔里，依次类推。轻轻混合，放入37℃CO₂培养箱中培养，并分别于脂质体2000转染293T细胞36小时、42小时和48小时观察培养效果；

k、重组蛋白MyoD1在293T细胞中的表达和检测

在荧光显微镜下观察转染后，在37℃CO2培养箱中已培养48小时的细胞293T阳性结果。

结果表明，PLEGFP-N1空质粒的转染效率可达80％，目的基因PLEGFP-N1-spMyoD1克隆质粒转染效率平均可达24％，最高达33％；

l、利用本发明的载体建立转pMyoD1基因鼠

①病毒包装取上述脂质体2000和DNA的混合液，用PT67细胞替代293T细胞，脂质体转染后4天开始收集上清液；

②病毒上清液1ml加到胚胎干细胞的培养基中，42小时荧光显微镜下观察，确定荧光克隆；

③荧光阳性克隆筛选进行G418筛选，保留目的基因的细胞克隆，收集病毒，进行保种；

④取受孕老鼠，经麻醉后，利用手术法从受孕的老鼠体内取囊胚，用自制持卵器在体式显微镜下进行微注射，把注射成功的囊胚再移植到受体老鼠子宫；

⑤受体老鼠妊娠、分娩、转基因老鼠诊断、哺育；

⑥转基因仔鼠断乳、饲养；

⑦转基因老鼠骨骼肌组织中目的基因pMyoD1的RT-PCR扩增检测：分别取30日龄转基因老鼠的骨骼肌、心脏、肝脏、肺脏、肠道、皮肤组织，并进行目的基因的RT-PCR扩增检测。

3.一种高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建的使用方法，其使用方法是：绿色荧光PLEGFP-N1-SP-pMyoD1逆转录病毒载体是已经过包被处理的，可直接用于转染待转的靶细胞或靶组织，在365nm波长紫外光激发下，阳性标本为绿色荧光观察及目的基因片段的PCR扩增方法检测鉴定。