[发明专利]使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法

权利要求书

1.使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)材料选取：“西伯利亚”(Siberia)、“索邦”(Sorbonne)种球；

(2)百合种球病毒的检测：选取供试种球的球茎鳞片，提取总RNA，反转录后作为模板，采用反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测，确定种球鳞片是否携带病毒；

(3)培养基的配制、备用：基本培养基为MS培养基；

采用正交法研究6-BA和NAA浓度对百合组培的影响，确定可直接分化成芽和无根组培苗的最适6-BA和NAA浓度，配制最佳诱导培养基；采用1，3，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18mg/L的浓度配制含抗病毒药物的培养基。抗病毒药物采用0.2u滤膜过滤除菌。

(4)外植体灭菌、接种：将检测被病毒感染的百合鳞茎用自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌10分钟，然后在70％酒精浸泡20秒。取出材料，用无菌水冲洗5-6遍。将材料切割成2.0mm×2.0mm小方块，接种于最佳诱导培养基上培养。

(5)外植体培养：在温度22±1℃，光照12h/d，光照强度1500Lx的环境条件下培养45-50天，百合鳞茎外植体直接分化成鳞茎芽和无根组培苗。进一步将叶片切下，将组培小鳞茎纵切2-4块分别接种于对照组(诱导培养基)和实验组(诱导培养基+一定浓度的抗病毒药物)上，继续培养；连续切割，继代三次后，RT-PCR检测病毒苗携带病毒的情况。

(6)组培苗病毒检测：根据检测病毒的种类：百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)，黄瓜花叶病毒(CMV)，百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)病毒，百合丛簇病毒(Lily rosettle virus，LRV)按照已知基因序列设计特异性引物，经RT-PCR检测无扩增为阴性脱毒苗。

2.根据权利要求书1所述的使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于最佳诱导培养基配方：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0％蔗糖+琼脂粉6.0g/L(PH 5.8)。

3.根据权利要求书1所述的使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于实验组所使用的药剂盐酸金刚乙胺(Rimantadine Hydiochloride)的最适浓度10mg/L，脱毒率可达到93％。