[发明专利]一种鸽性别鉴别方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种鸽性别鉴别方法。

背景技术

鸽早期配对准确是鸽场实用技术之一。鸽是严格的一夫一妻制，如果错配，不仅鸽间斗殴，而且母鸽不产蛋。目前，除个别品种鸽可根据羽毛自辨雌雄外，绝大多数品种的鸽，包括乳鸽、青年鸽，乃至成年鸽，不能通过体型、体态、翻肛等形态学方法来进行雌雄鉴别。虽极富经验的饲养人员可通过体型、体态等来鉴别个别成年鸽雌雄，但准确率不高。

鸟类性染色体由ZZ（雄性）和ZW（雌性）组成，并由此近年来研发成了根据ZW染色体上CHD（Chromo-helicase-DNA binding gene）基因的扩增片段长度不同而鉴定鸟类性别的PCR方法。目前用于鸟类性别鉴定的PCR引物主要是Griffiths（1998）设计的P2/P8和Fridolfsson（1999）设计的2550F/2718R，且作为所有鸟类性别鉴定的通用引物；鸟类性别鉴定，包括鸽的性别鉴定所用基因组DNA模板大多是从血液样本或多根主翼羽羽髓中提取。以上方法不足之处在于，抽取动物血样或拨取多根主翼羽易对鸟类或鸽造成伤害；基因组DNA提取方法大多采用常规方法，此方法不仅提取过程繁琐，而且不能确保基因组DNA提取的一次性成功，而且成本相对较高；PCR鉴定用引物大多采用以上所述二种通用引物及其它相应引物，但一次性检出率事实上不太理想。

发明内容

本发明目的是针对现有技术的上述不足提供一种鸽性别鉴别方法，该法无需取血，只需1根含少量羽髓的腹侧羽毛即可鉴定鸽性别，准确率高达100%。

本发明的技术方案如下：

一种鸽性别鉴别方法，通过比对鸽CHD基因的2550F/2718R引物扩增产物与NCBI登录的CHD基因序列（AY517718、AY517719），设计出上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，利用此上、下游引物，通过PCR技术从鸽羽髓细胞制备的基因组DNA模板中扩增Z和W性染色体上的CHD基因片段，经过EB染色，1%琼脂糖凝胶电泳，然后凝胶成像条带分型判断性别，出现两条带，即628bp和358bp的为雄性；出现三条带，即628bp、420bp和358bp的为雌性。

所述的鸽CHD基因片段扩增的PCR反应体系为：双蒸水6.05μl、25mM Mg²⁺1.0μl、10×Buffer 1.0μl、5mM dNTP0.4μl、5μM上、下游引物各0.5μl、Taq酶0.05μl、基因组DNA模板0.5μl；。反应条件为：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 40秒，35个循环。

所述的鸽基因组DNA模板提取方法如下：（1）拨取含少量羽髓的鸽腹侧初生羽毛1根，并取0.2-5mg羽髓于离心管或PCR管中；（2）向离心管或PCR管中加入微量动物细胞基因组DNA模板制备液；（3）将所述的装有羽髓和微量动物细胞基因组DNA模板制备液的离心管或PCR管95℃保温5分钟，16℃保温5分钟；（4）向所述的离心管或PCR管中加入蛋白酶K；（5）55℃保温2小时，95℃保温10分钟，16℃保温5分钟，离心上清直接用作PCR的DNA模板。

所述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液由A液和B液以1:3-10的体积比混合制得，其中所述的A液为Tris、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂的混合溶液，三种试剂终浓度均为0.1-2.0M；所述的B液为Triton和β-琉基乙醇的混合稀释液，二种试剂终浓度均为0.1-2.0%。A液、B液的溶剂均为双蒸水。

所述的蛋白酶K溶液的终浓度为1.0-3.0mg/ml。

制备基因组DNA模板时加入的蛋白酶K溶液与微量动物细胞基因组DNA模板制备液的体积之和为10μl；优选所述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液体积为8.8μl，所述的蛋白酶K溶液（10 mg/ml）的体积为1.2μl。