[发明专利]一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株及其构建方法

权利要求书

1.一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株，其特征在于：是将人干扰素-alpha基因转染入自然杀伤细胞株NKL细胞，构建成的稳定分泌、表达人干扰素-alpha的细胞株。

2.权利要求1所述的一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离人外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，扩增人IFN-α的cDNA片段，长度为569bp；

(2)将上述RT-PCR产物与T-载体连接，构建T-IFNα，然后转入感受态大肠杆菌DH5α，过夜培养，提取质粒测序鉴定，筛选阳性克隆，对于测序正确的阳性克隆，提取纯化T-IFNα；

(3)对T-IFNα和表达载体psectag-B分别进行BamH I和EcoR I的双酶切，并回收目的条带；

(4)将步骤(3)制得的酶切后的载体片段与IFN-α条带进行连接，产物转入感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子，提取纯化psectagB-IFNα载体；

(5)将psectagB-IFNα载体通过电转入自然杀伤细胞株NKL细胞，将电转后的细胞转入筛选培养基，筛选培养基为：含终浓度为50mg/L Zeocin的1640完全培养基，培养3～4天，从中挑选出阳性细胞克隆；

(6)将上述阳性细胞克隆在含10％胎牛血清、100活性单位的IL-2的1640培养基中进行扩增，即得到人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中，扩增所用引物序列为：

IFN-α-F：5′-TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3′；

IFN-α-R：5′-CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3′；

PCR反应条件为：95℃变性5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min。