[发明专利]一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株及其构建方法，属于肿瘤的过继免疫治疗领域。

背景技术

众所周知，NK细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线，故NK细胞在肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注，输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植辅助治疗及抗肿瘤生物治疗的新策略。但NK细胞体外扩增效率低，因此建立NK细胞株成为肿瘤生物治疗的重要手段。

NKL细胞株来源于CD3-CD16+CD56+的大颗粒淋巴细胞白血病患者的外周血，具有广谱的细胞毒活性，具有良好的临床应用前景。

干扰素是具有抗病毒、抗增殖和调节免疫活性的一种糖蛋白，多项实验证明干扰素-alpha具有抗肿瘤作用。

基于上述现有技术，如果能够建立人干扰素-alpha基因修饰的NKL细胞株，则有望能够进一步增强NKL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，提高其对刺激的敏感性和活化程度，能够更加符合过继免疫治疗的要求，更适合应用于肿瘤的生物治疗。迄今为止，未见有关建立人干扰素-alpha基因修饰的NKL细胞株的相关报道。

发明内容

针对上述肿瘤过继免疫治疗的现状，针对干扰素-alpha的作用特点，本发明的目的是建立一种人干扰素-alpha基因修饰的NKL细胞株，使其更加符合肿瘤生物治疗的要求。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株，是将人干扰素-alpha基因转染入自然杀伤细胞株NKL细胞，构建成的稳定分泌、表达人干扰素-alpha的细胞株。

一种人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株的构建方法，包括以下步骤：

(1)分离人外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，扩增人IFN-α的cDNA片段，长度为569bp；

(2)将上述RT-PCR产物与T-载体连接，构建T-IFNα，然后转入感受态大肠杆菌DH5α，过夜培养，提取质粒测序鉴定，筛选阳性克隆，对于测序正确的阳性克隆，提取纯化T-IFNα；

(3)对T-IFNα和表达载体psectag-B分别进行BamH I和EcoR I的双酶切，并回收目的条带；

(4)将步骤(3)制得的酶切后的载体片段与IFN-α条带进行连接，产物转入感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性重组子，提取纯化psectagB-IFNα载体(人干扰素-alpha的分泌型重组真核表达载体)；

(5)将psectagB-IFNα载体通过电转入自然杀伤细胞株NKL细胞，将电转后的细胞转入筛选培养基，筛选培养基为：含终浓度为50mg/L Zeocin的1640完全培养基，培养3～4天，从中挑选出阳性细胞克隆；

(6)将上述阳性细胞克隆在含10％胎牛血清、100活性单位的IL-2的1640培养基中进行扩增，即得到人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞株。

所述步骤(1)中，扩增所用引物序列为：

IFN-α-F：5′-TTAGGATCCATGGCCTCGCCCTTT-3′；

IFN-α-R：5′-CGCGAATTCGTTATTCCTTCCTCC-3′；

PCR反应条件为：95℃变性5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min。

本发明所构建的人干扰素-alpha基因修饰的自然杀伤细胞NKL细胞株，经RT-PCR及ELISA检测鉴定能够在胞内表达，并将合成的IFN-α分泌到胞外培养上清中。进一步研究表明，人IFN-α基因修饰的NKL细胞株能够有效杀伤肝癌细胞HepG2、H7402、PLC/PRF-5和HepG2.2.15，这种抗肿瘤效应与NKL-IFNα细胞IFN-γ、Granzyme、TNF-α和Perforin基因和蛋白的表达水平提高相关。并且修饰后的NKL细胞株对外界刺激更加敏感，在肝癌细胞HepG2，HepG2.2.15，或者刺激剂PMA刺激下，能够分泌更多IFN-γ。因此，本发明的人IFN-α基因修饰的NKL细胞的生物学特征更有利于临床过继免疫治疗的应用。