[发明专利]糖核苷酸的酶法制备

权利要求书

1.糖核苷酸的酶法制备，包括三类糖核苷酸，分别是GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc，由下述步骤组成：

(1).酶表达载体的构建：

克隆出GDP-Fuc合成酶(FKP)、氮乙酰六糖胺激酶(NahK)、GlcNAc-1-Puridyltransferase(GlmU)、CMP-Sia合成酶(NmCSS)，经酶切后插入大肠杆菌载体，分别命名为v-FKP、v-NahK、v-GlmU、v-NmCSS；

(2).酶的过量表达与纯化：

上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。 阳性克隆工程菌株接种于LB培养基中，37℃培养10-12小时后转接入新的LB培养基中，37℃继续培养2-4小时，摇床转速为200-250转/分钟；当方发酵液浓度达到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达20小时，温度为16℃，摇床转速为200-250转/分钟；菌体通过离心收集，经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白；

(3).糖核苷酸GDP-Fuc的酶法制备与纯化

以等物质的量的L-岩藻糖、ATP、GTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁和每克反应10个单位的焦磷酸水解酶，反应在GDP-Fuc合成酶FKP的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后， 反应液与活性炭混合，使用10体积的水和20体积的10％的乙醇洗涤，然后使用含有5％氨水的35％乙醇洗脱；洗脱液经浓缩并真空抽去氨水和乙醇后进行离子交换纯化，最后使用氯化钠溶液洗脱；得到的溶液使用活性炭除盐。

(4).糖核苷酸CMP-Sia的酶法制备与纯化

以等物质的量的唾液酸、CTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁，反应在CMP-Sia合成酶NmCSS的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，使用与步骤(3)中相似的方法纯化；

(5).糖核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc的酶法制备与纯化

以等物质的量的氮乙酰葡萄糖胺/氮乙酰半乳糖胺、ATP、UTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁和每克反应10个单位的焦磷酸水解酶，反应在NahK和GlmU的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后， 反应液与活性炭混合，使用与步骤(3)中相似的方法纯化。

2.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的GDP-Fuc合成酶是来源于人体共生微生物Bacteroides fragilis的FKP。

3.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的GlcNAc-1-P uridyltransferase是来源于大肠杆菌K12的GlmU。

4.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的氮乙酰六糖胺激酶是来Bifidobacterium longum的NahK。 

5.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的CMP-Sia合成酶是来源于Neisseria meningitidis的NmCSS。

6.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(1)中所述的载体为pET15b、pET22b等大肠杆菌表达载体及在此基础上改造的载体。

7.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(2)中所述的大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)或其他含有DE3特性的大肠杆菌菌株。

8.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(2)中所述的IPTG浓度为0.2-0.4mM。

9.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(3)、(5)中所述的反应pH值均为8，使用氢氧化钠溶液调节pH。

10.如权利要求1中所述糖核苷酸的酶法制备，其特征是，步骤(4)中所述的反应pH值均为9，使用氢氧化钠溶液调节pH，并使用100mM Tris-HCl作为缓冲体系。