[发明专利]糖核苷酸的酶法制备

说明书

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体地说，涉及包括GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc在内的糖核苷酸的酶法制备方法。 

背景技术

糖类是生物体内最基本的组成部分之一，糖结构的表达异常是肿瘤表型的标志之一。结构均一性糖链的获得是破解它们生物功能谜题的先决条件。人们开发了多种合成复杂糖结构的方法和工艺。这个前沿领域的发展 为糖链功能的测定，糖链结构-功能关系的解析，生物合成途 的阐明，以及基于糖的抗菌抗癌疫苗的生产奠定基础。体外糖合成有两种常用策略：化学合成和酶法(包括化学-酶法)合成。复杂糖链目前依然是有机化学合成中具有挑战性的化合物。 

实践检验，酶法合成被证明是化学合成的有效替代途 。与化学方法相此，酶法合成在更为有效进行高度空间和立体化学特异性的糖基化反应方面具有明显的优势。用于糖合成的酶主要是糖基转移酶。而糖基转移酶催化的反应需要糖核苷酸作为糖基供体。如下图所示，其中R代表不同的核苷。 

糖核苷酸价格昂贵，如GDP-Fuc的价格为5mg/$594(Sigma)，CMP-Sia的价格为5mg/$189，UDP-GalNAc的价格为5mg/$159。这是由于糖核苷酸极难化学合成，而如GDP-Fuc等在内的糖核苷酸在生物体内纯在较少，生物提取 接提高了其成本。之前的酶法合成则需要多酶反应，也比较复杂，难以大量合成。如以前GDP-Fuc的酶法合成使用De novo路线，如下图，其需要本身就昂贵的GDP-Man作为底物，分两步反应得到GDP-Fuc，而GDP-Man、GDP-Fuc以及其生成的中间产物结构极为相似，造成纯化生的困难。其他几种糖核苷酸如CMP-Sia、UDP-GalNAc的合成也是如此。 

发明内容

本发明的目的在于提供酶法大量制备包括GDP-Fuc在内的昂贵糖核苷酸的方法，该方法所使用的是糖核苷酸的Salvage Pathway路线，如上图中GDP-Fuc 的Salvage路线。使用本发明的方法，能够一价格低廉的单糖作为合成底物，经过两步简单的生物反应，大量制备糖核苷酸。 

本发明所涉及的糖核苷酸的酶法制备，由下述步骤组成： 

(1).克隆表达载体的构建： 

克隆出FKP使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-FKP；克隆出NahK使用酶切位点NdeI和XhoI构建入载体pET22b，命名为v-NahK；克隆GlmU使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-GlmU、克隆NmCSS使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-NmCSS； 

(2).酶的过量表达与纯化： 

上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。 阳性克隆工程菌株接种于LB培养基中，37℃培养10-12小时后转接入新的LB培养基中，37℃继续培养2-4小时，摇床转速为200-250转/分钟；当方发酵液浓度达到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达20小时，温度为25℃，摇床转速为200-250转/分钟；菌体通过离心收集，经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白； 

其中LB培养基的配方为：10g/L蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/L氯化钠； 

其中亲和层析使用镍离子亲和树脂；纯化使用平衡缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，5mM4咪唑；清洗缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，25mM咪唑；洗脱缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，250mM咪唑； 

(3).糖核苷酸GDP-Fuc的酶法制备与纯化 

以等物质的量的L-岩藻糖、ATP、GTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁和每克反应10个单位的焦磷酸水解酶，反应在GDP-Fuc合成酶FKP的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后， 反应液与活性炭混合，使用10体积的水和20体积的10％的乙醇洗涤，然后使用含有5％氨水的35％乙醇洗脱；洗脱液经浓缩并真空抽去氨水和乙醇后进行离子交换纯化，最后使用氯化钠溶液洗脱；得到的溶液使用活性炭除盐。 

(4).糖核苷酸CMP-Sia的酶法制备与纯化