[发明专利]一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法

权利要求书

1.一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含75%质量分数的酒精消毒10s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl₂消毒4min，无菌水冲洗4次；

步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：MS+（0.5～1.0）mg/L 2,4-D+（0.1～0.5）mg/L KT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25+1℃，保持每天16小时的光照，光照强度为1000～1500lx，20～30天后形成愈伤组织；

步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为：6,7-V+1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT；

步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为5%～10%（w/v），接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为1/2MS+60ml/L椰汁，选择250 mL三角瓶，装培养基120 mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25+1℃，自然光照，摇床转速110转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养3次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系；

步骤五，用对数期生长的雷公藤悬浮细胞系，选取直径在1mm以下、分散性好、颗粒状雷公藤悬浮细胞系转接在1/2MS+（0.5～1.0）mg/LNAA培养基上进行胚状体的诱导，接种量为鲜重5g/L～10g/L，培养30天可产生胚状体，继续培养至60天，有85%的细胞团产生长度为0.5cm～3cm的胚状体；

步骤六，胚状体的稳定性培养：继代时在超净工作台上，挑选步骤五诱导的胚状体中，长度为1cm～2cm、分散性好，颜色鲜亮、有明显分化的胚状体，进行继代培养，在步骤五相同培养基上连续培养5代以上，即可形成稳定的胚状体培养体系；同时将筛选的生长旺盛、颜色鲜亮、分化明显的胚状体，继代保存在1/2MS+（0.5～1.0）mg/LNAA培养基中，30天继代一次，1/2MS培养基组成为NAA 0.5～1.0 mg/L，蔗糖30～40 g/L，pH值为5.8；

步骤七，对胚状体进行生产培养时，1/2MS培养基组成为NAA 0.5～1.0 mg/L，蔗糖30～40 g/L，pH值为6.1，培养至第40天收获。