[发明专利]一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种雷公藤胚状体培养方法，特别是一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法，该方法生产的雷公藤胚状体中所含的雷公藤甲素和总生物碱与野生植株所含的雷公藤甲素和总生物碱几乎相同，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

背景技术

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）系卫矛科雷公藤属植物，在我国很早以前就用于医学和防治各种害虫，为著名的杀虫植物之一。民间多用于防治蔬菜害虫，故有“菜药”之称。其对多种害虫有效。传统中医上可用于治疗肿胀、水肿、黄白疽、痢疾等，具有明显的抗肿瘤、抗风湿作用。雷公藤属多年生木质藤本、生长缓慢、处于野生状态，因用根入药，大量应用使资源遭到破坏。

雷公藤根中的活性成分含量显著高于其他部位，是主要药用部位。现已从中分离出70多种化学成分，其中雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇，是中药雷公藤的主要有效成分之一，作为免疫抑制药物，可应用于许多自身免疫性疾病的治疗，同时它又是一种毒性成分。雷公藤生物碱具有明显的体液和细胞免疫抑制作用，也是治疗类风湿性关节炎的有效成分。在农业害虫防治中，雷公藤甲素有较好的触杀活性，雷公藤总生物碱有较好的胃毒毒杀活性和拒食活性。这些有效成分均为次生代谢产物，在雷公藤植株内含量很低，在其他植物内的含量更低，虽然可通过化学分离提取获得产品，但受气候、土壤、分布等因素及有效成分含量、原料、季节等条件的限制，生产受到一定的限制，加上人类对自然的过度开发，资源受到破坏，提取量很有限。

雷公藤细胞培养生产有效成分在国内外已进行了大量研究。在国内，尹作鸿等人从雷公藤的茎、叶诱导出愈伤组织，并进行了组织培养，从中分离得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜内酯化合物。曹华兴等（2002年）申请中国发明专利，提出采用悬浮法培养雷公藤植物细胞而生产雷公藤总生物碱的方法，该方法得到的产物所含雷公藤总生物碱的含量为植物体的2.9倍。张兴等（2008）公开的发明专利，建立了雷公藤的不定根培养体系，该方法得到的不定根中雷公藤甲素和总生物碱的含量分别为根皮粉的13倍和1.8倍，培养液中雷公藤甲素产量占55～60％，总生物碱产量占60～65％。李琰等（2008）建立并筛选出了适合通过二步细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的细胞悬浮体系及其相应的生长培养基和生产雷公藤甲素培养基以及雷公藤生物碱培养基配方并申请专利。在国外，日本Kyowa Hakko kogyo公司也为组织培养生产雷公藤内酯醇和雷公藤内酯二醇申请专利。这些对雷公藤细胞培养的研究从不同方面进行了有益的探索，但远未达到工业化生产的水平。而关于雷公藤胚状体悬浮培养法生产雷公藤甲素和总生物碱的方法尚未见到报道。

一般来说，植物的次生代谢产物在已经分化的组织中含量较高，且器官培养相对比较稳定，因此采用胚状体或根培养的方法是生产次生代谢产物的另一条途径。胚状体的培养对植物有着特殊的意义，因为许多植物在器官分化之后次生代谢物会增加。但工业化培养生产胚状体的实例并不多，多见于根的培养。韩国目前在高丽参根类培养方面已经取得了突破性进展，采用了5～10 t的反应器，并以培养的根为原料开发了系列产品。用有一定的器官分化的胚状体作为悬浮培养的材料，生产其代谢产物，要比细胞培养有效成分要高得多，但胚状体的诱导需要克服更多技术上的困难，并非所有植物均可进行胚状体诱导。

植物细胞全能性的设想于1902年提出，1948年得到了证实，这为进行植物组织培养工作奠定了理论基础，自从1956年Routine和Nickel首次申请用植物组织培养生产有用次生代谢产物的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。大量研究成果证明，通过植物细胞发酵培养产生有用的次生代谢产物越来越显示出巨大的应用潜力。利用植物细胞培养生产次生代谢产物不受地理、季节变换和各种环境因素的影响；可节省土地，降低成本，缩短生产周期；可以提供一种标准化的生产过程，该过程可以连续生产，产品的质量和产量稳定，便于实行工业化生产，已是解决各种有效成分含量低的植物资源利用的主要途径。这是本申请的试验基础和理论基础。

发明内容

为了保护雷公藤的自然资源，本发明的目的在于提供由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：