[发明专利]一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法

权利要求书

1.一种流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)细胞的接种和吸附培养：将哺乳动物细胞接种到潮汐式生物反应器载体罐(8)内的载体(9)上，进行细胞的吸附培养；

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养；

3)将流感病毒接种到扩增培养的细胞上，进行病毒的吸附培养；

4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养；和

5)在病毒含量达峰值后，收获含有流感病毒的培养液，

其中步骤1)至4)中的培养在潮汐培养条件下进行，所述潮汐培养条件是通过泵出或泵入载体罐(8)内的培养液以间歇性淹没与暴露载体实现的。

2.根据权利要求1所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐(8)与装有培养液的培养液袋(6)以能够将培养液袋内的培养液泵入载体罐中和能将载体罐内的培养液泵入培养液袋中的方式相联通。

3.根据权利要求1所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐中的载体由选自多糖类、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、明胶、玻璃、纤维素、聚乙烯和塑料中的一种或多种制成。

4.根据权利要求3所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐中的载体是台湾CESCO Bioengineering公司生产的“BioNOC II”载体。

5.根据权利要求1所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述载体罐中的载体占载体罐容积的40％～100％(V/V)。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的潮汐式生物反应器载体罐容积为2～200L。

7.根据权利要求1～5任一项所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述流感病毒是A型流感病毒或B型流感病毒。

8.根据权利要求7所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的A型流感病毒为选自H1、H3、H5、H7和H9亚型中的一种。

9.根据权利要求8所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的A型流感病毒为选自H9N2、H1N1、H5N3、H7N2和H3N2亚型中的一种。

10.根据权利要求9所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤3)中的病毒接种按照感染复数为0.001～1进行。

11.根据权利要求10所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤3)中的病毒接种按照感染复数为0.01～0.1进行。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为MDCK细胞系或Vero细胞系。

13.根据权利要求12所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤1)中以0.5×10⁷～5×10⁷cells/g载体的终密度接种细胞。

14.根据权利要求13所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，在步骤2)中的细胞扩增培养达到0.7×10⁸～10×10⁸cells/g载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。

15.根据权利要求14所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩增培养使用含2％～10％(V/V)牛血清的细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用无血清的细胞培养液，其中所述的细胞培养液为选自DMEM、MEM、α-MEM、EMEM、1640、M199、F10和F12中的一种，所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。

16.根据权利要求15所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述的无血清的细胞培养液中添加了TPCK胰酶。

17.根据权利要求16所述的流感病毒的大规模生产方法，其特征在于，所述无血清的细胞培养液中添加的TPCK胰酶浓度为0.5～10mg/L。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述无血清的细胞培养液中添加的TPCK胰酶浓度为1～5mg/L。