[发明专利]一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产流感病毒的方法。更具体地说，本发明涉及一种利用潮汐式生物反应器进行流感病毒大规模生产的方法。

背景技术

流感病毒属于正黏病毒科，根据其内部蛋白(主要是NP蛋白和M1蛋白)的血清学反应情况，可分为A(甲)、B(乙)和C(丙)三个型(属)。B和C型流感病毒主要感染人，极少情况下感染海豹和猪，但从来没有在鸟类中分离到。A型流感病毒可根据糖蛋白HA和NA的血清学反应情况进一步分为16个HA亚型和9个NA亚型。由16个HA亚型和9个NA亚型组合的大部分流感病毒亚型主要存在于禽类和动物中，其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。禽流感病毒根据其致病力又有高致性和低致病性之分。世界各地发生的高致病性禽流感主要以H5和H7亚型为主，致死率高，一旦发生往往造成巨大经济损失。而低致病性禽流感，如H9亚型，也可以引起家禽的生产性能下降，并在混合感染的情况下造成一定死亡。另因其传播效率高，流行范围广，也造成巨大危害。目前，使用病毒灭活疫苗仍然是防制流感疫情发生的重要手段。

使用鸡胚培养流感病毒是目前制备人和禽流感灭活疫苗的主要方法，但这种生产体系存在一定程度的缺陷：用鸡胚传代流感病毒易引起病毒的抗原性变异；大规模生产时存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污染的问题；病毒液(即鸡胚尿囊液)中存在着大量的杂蛋白影响疫苗的安全性和稳定性等。

以哺乳动物细胞为基质制备流感病毒疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好维持病毒抗原稳定等优点，常用的有MDCK(Madin-Darby canine kidney，Madin-Darby犬肾)细胞系和Vero(非洲绿猴肾)细胞系等。流感病毒在MDCK细胞系中增殖稳定、适应性较强，而且MDCK细胞系贴附依赖性细胞，可以应用于载体或微载体大规模培养流感病毒。

李春艳等(见文献：微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究，中国人兽共患病学报，2009，25(12)，1149-1153)曾研究应用微载体进行MDCK细胞的规模化培养并增殖H9N2亚型禽流感病毒，但技术方案中是将MDCK细胞置于转瓶中，而不是于生物反应器中进行培养。其与传统的无载体转瓶培养方式相比，虽在一定程度上提高了细胞培养密度，降低了劳动强度，但这种技术方案也存在着一些与传统的转瓶培养所共有缺点：(1)转瓶细胞培养，不能对培养液的养分、pH及溶氧等培养条件进行实时调整，因此无法保证细胞处于最佳培养状态；(2)转瓶细胞培养，操作程序繁琐，有污染风险的暴露点多，生产工艺难放大；(3)转瓶细胞培养，批间差异大，生产质量难以控制，产品质量不稳定。可见，使用转瓶的培养方式已经制约了流感病毒的规模化培养。

近年来，不少研究者开始尝试用生物反应器替代转瓶，培养细胞并增殖流感病毒。现有技术中，用于培养贴附依赖性真核细胞的生物反应器均需要借助载体或微载体来提供细胞赖以贴附与生长的表面。微载体是指直径在60～250μm，能供细胞贴附与生长的微珠。此微载体必须与具有搅拌或充气能力的设备结合，在培养液内随着轻柔的搅拌而悬浮于器皿中，其中搅拌是为了确保所有细胞皆能分配到同量的营养。

中国专利CN1807599A中报道了一种用自制的生物反应器培养MDCK或Vero细胞以生产病毒(包括流感病毒)的方法。中国专利CN101627113A中报道了一种在单次使用生物反应器中培养新型MDCK细胞，并增殖病毒(包括流感病毒)的方法。中国专利CN101062411A中报道了一种使用固定床篮式搅拌生物反应器及悬浮培养生物反应器培养Vero细胞并增殖流感病毒的方法。中国专利CN101094915A中报道了一种使用灌流式(含倾析器)的生物反应器以培养MDCK衍生细胞系，并生产人流感疫苗病毒的方法。以上4例报道中所用反应器的培养方式均为搅拌式而非潮汐式，即通过搅拌的方式使培养基达到均质，以促使细胞的新陈代谢。然而，这种搅拌的培养方式所产生的高剪切力会导致细胞损耗率高，进而影响到生物反应器的生产效率及细胞产量。

中国专利CN1433472的实施例8及实施例9中使用了中空纤维灌流生物反应器增殖人体细胞，并生产流感病毒的方法。其中所用的人体细胞为非贴附依赖型细胞，是通过悬浮方式培养培养的，而没有借助于载体或微载体进行培养。因此这种培养方式也不能实现载体或微载体培养所具有的高密度优点，其生产工艺亦存在着高成本、难以放大的缺点。