[发明专利]柑橘品种标准DNA指纹图谱库及其构建方法

权利要求书

1.柑橘品种标准DNA指纹图谱库，它是包括柑橘品种DNA和SSR特征引物对序列为材料，通过柑橘标准DNA指纹图谱库构建得到；其特征在于：所述SSR特征引物为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:40所示的序列。

2.如权利要求1所述的柑橘品种标准DNA指纹图谱库，其特征在于：所述柑橘品种DNA来自下表所述的柑橘品种

 。

3.如权利要求1或2所述的柑橘品种标准DNA指纹图谱库的构建方法，按如下步骤进行：

a. 柑橘各品种总DNA提取

提取所述各柑橘品种的总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和总分光光度计检测总DNA的质量，使提取的总DNA完整性好，且 A260/A280比值在1.6-2.0之间；

b. SSR特征引物对序列的筛选

SSR引物来源：选择分布于不同的连锁群上的引物对序列，合成， PAGE纯化；

SSR特征引物对序列的筛选：以所述柑橘品种为材料，利用所述合成的SSR引物对各柑橘品种的DNA进行PCR扩增；

引物的筛选首先是根据所述合成的SSR引物在各个柑橘品种中PCR扩增出的谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出一批在不同柑橘品种间多态性丰富、带型清晰而且特征谱带能够稳定重复的SSR引物；然后，找出一对在所述柑橘品种间多态性信息含量PIC最高，等位位点数最多的SSR引物作为柑橘品种指纹图谱库构建的核心引物，根据所述核心引物的特征指纹将所述柑橘品种划分为9个类群即为9个等位位点；进一步，以所述核心引物的区分结果为基准，在这9个类群中检测，每次检测到一个具有多态性的SSR引物进一步筛选，以此类推，这样将其划分为更多的类群，直到把各类群分到只有一个品种为止；最终从所述合成的柑橘SSR引物对序列中筛选得到来自多个连锁群的SSR特征引物对序列；

c. 柑橘DNA特征指纹图谱的获得

利用所述筛选得到来自多个连锁群的SSR特征引物对序列，分别对所述各柑橘品种DNA进行PCR扩增，得到所述各柑橘品种的DNA特征指纹图谱；

d. 柑橘标准DNA指纹图谱库的构建

应用指纹图谱自动识别系统对所述各柑橘品种的DNA特征指纹图谱进行识别和处理，然后将各柑橘品种的DNA特征指纹图谱转换成柑橘品种标准DNA指纹图谱库。

4.如权利要求3所述的方法，按以下步骤：

a.柑橘各品种总DNA提取

提取各柑橘叶片的总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和总分光光度计检测总DNA的质量，使提取的总DNA完整性好，且 A260/A280比值在1.6-2.0之间，然后将总DNA稀释成100ng/μL, 储存于-20℃备用；

b. SSR特征引物对序列的筛选

引物来源：选择分布于不同的连锁群上的引物对序列，合成，均由上海生工Sangon合成，要求PAGE纯化；

SSR特征引物对序列的筛选：以所述各个柑橘品种为材料，利用所述合成的SSR引物对各柑橘品种的DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物利用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后银染显色，照相记录；

引物的筛选首先是根据所述合成的SSR引物在各个柑橘品种中PCR扩增出的谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出一批在不同柑橘品种间多态性丰富、带型清晰而且特征谱带能够稳定重复的SSR引物，然后，找到一对在各个柑橘品种间多态性信息含量即PIC最高，等位位点数最多的SSR引物作为柑橘品种指纹图谱库构建的核心引物，根据所述核心引物的特征指纹将各柑橘品种划分为9个类群即9个等位位点；进一步，以所述核心引物的区分结果为基准，在这9个类群中检测，每次检测到一个具有多态性的SSR引物进一步筛选，以此类推，这样将其划分为更多的类群，直到把各类群分到只有一个品种为止，经过这样的逐步分析，最终筛选到SSR特征引物对序列，作为构建柑橘品种DNA指纹图谱库的特征引物；

c. 柑橘DNA特征指纹图谱的获得

利用所述b步骤中筛选获得的SSR特征引物对序列，分别对所述各个柑橘品种进行PCR扩增，电泳及显色，并照相记录结果，获得各柑橘品种的DNA特征指纹图谱；在所述电泳时对每块凝胶上设置相同的DNA Marker和PCR产物作参照；

d.柑橘标准DNA指纹图谱库的构建

应用指纹图谱自动识别系统Gel 2.0、gelquest、Cross checker、Total Lab或IMAGE package对所述各柑橘品种的DNA特征指纹图谱进行识别和处理，以DL2000 DNA Marker作参照，识别系统将根据DNA Marker中谱带的迁移位置自动计算出所述指纹图谱中各品种每条SSR特征谱带的相对迁移率，然后根据相对迁移率大小将各品种的SSR特征指纹转换成可比对的柑橘品种标准DNA指纹图谱库。