[发明专利]柑橘品种标准DNA指纹图谱库及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及指纹图谱库及其构建方法，具体涉及一种柑橘品种DNA指纹图谱库及其构建方法。

背景技术

柑橘是世界第一大水果，全球种植面积670万公顷，年产量超过1亿吨，年贸易额234亿美元，是仅次于小麦、玉米和大豆的第四大国际贸易农产品。我国是世界上柑橘栽培面积最大的国家，柑橘总产量达2300万吨，居世界第一位。近30年来，国外培育出上百个柑橘新品种，而我国选育出了数十个柑橘优良新品种。可是，目前我国柑橘种苗行业管理制度还不够完善，以劣充优，以假种苗坑农事件时有发生，不仅损害了种植者的利益，也对柑橘产业的健康发展构成了极大的威胁。

国际植物新品种保护联盟（UPOV）把特异性（distinctness）、一致性（ uniformity）和稳定性（stability）作为新品种登记和保护的必备特征。这些特征作同样可以作为品种鉴定的依据。长期以来，品种特性鉴定一直采用以形态性状为主要依据。这种经典的鉴定一般要在植株特定生长发育时期（果实、种子）才能进行，因而鉴定周期较长；而且农艺性状易受栽培管理和环境条件的影响。柑橘是多年生木本植物，易发生芽变，很多亲缘关系相近的品种间农艺性状差异较小，甚至只有单一性状的不明显变异，而且目前柑橘生产上一般要在种苗定植后2－4年的才能开花结果，若此时才利用依靠形态学标记来鉴定品种真伪已无实际意义。

随着分子生物学的发展，各种DNA分子标记技术不断涌现，检测技术渐趋完善，为实现柑橘种苗质量的早期、快速和准确鉴定提供了新途径。柑橘中也有利用分子标记技术开展研究（Barkley et al. 2006; Pang et al. 2003;刘勇等2005; Corzza-Nunes et al. 2002），但他们都侧重于对某类柑橘资源材料的亲缘关系进行研究；目前还没有建立柑橘品种DNA指纹图谱库从而鉴别品种的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供柑橘品种标准DNA指纹图谱库，为从DNA水平鉴定柑橘品种提供依据，本发明建立的柑橘品种标准DNA指纹图谱库可直接用于柑橘品种的鉴定。

本发明的另一目的在于提供上述柑橘品种标准DNA指纹图谱库的构建方法。

本发明的目的是这样实现的：

柑橘品种标准DNA指纹图谱库，它是包括柑橘品种DNA和SSR特征引物对序列为材料，通过柑橘标准DNA指纹图谱库构建得到；其特征在于：所述柑橘品种DNA来自下表所述的柑橘品种

  ；所述SSR特征引物为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:40所示的序列。

上述柑橘品种标准DNA指纹图谱库的构建方法，按如下步骤进行：

a. 柑橘各品种总DNA提取

提取上述各柑橘品种叶片的总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和总分光光度计检测总DNA的质量，使提取的总DNA完整性好，且 A260/A280比值在1.6-2.0之间；

b. SSR特征引物对序列的筛选

SSR引物来源：其中引物对序列来自江东等（2006）的方法设计和前人的报道（Kijas et al. 1995, 1997; Chen et al. 2006; Ahmad et al. 2003; Valdenice et al. 2006; 江东等2006），其是分布于不同的连锁群上的，将所述引物对序列进行合成， PAGE纯化；

SSR特征引物对序列的筛选：以上述96个柑橘品种为材料，利用上述合成的SSR引物对各柑橘品种的DNA进行PCR扩增；

引物的筛选首先是根据上述合成的SSR引物在96个品种中PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛，筛选出一批在不同柑橘品种间多态性丰富、带型清晰而且特征谱带能够稳定重复的SSR引物；然后，找出一对在上述柑橘品种间多态性信息含量PIC最高，等位位点数最多的SSR引物作为柑橘品种指纹图谱库构建的核心引物，根据所述核心引物的特征指纹将上述96个柑橘品种划分为9个类群即为9个等位位点；进一步，以所述核心引物的区分结果为基准，在这9个类群中检测，每次检测到一个具有多态性的SSR引物进一步筛选，以此类推，这样96个品种将会被划分为更多的类群，直到把各类群分到只有一个品种为止；最终从上述合成的柑橘SSR引物对序列中筛选得到来自多个连锁群的SSR特征引物对序列；

c. 柑橘DNA特征指纹图谱的获得