[发明专利]一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法。

背景技术

组织工程(Tissue Engineering)是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用。

组织工程的基本原理和方法是：将体外培养扩增的正常组织细胞作为种子细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物支架材料上形成复合物，将细胞-支架材料复合物植入机体组织、器官的病损部位，种子细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。采用组织工程学技术修复缺损的组织器官，具有移植材料来源广泛、移植物可以在体外成行、避免或降低了免疫排斥反应和感染性疾病的播散等优点。目前采用组织工程技术已成功构建皮肤、膀胱、肌腱、骨、软骨等组织。

椎间盘退变性疾病是现代社会中一种常见病和多发病，其中以椎间盘突出症最为常见，是引起腰腿痛的常见病因，严重影响患者生活质量。组织工程修复椎间盘退行性变是近年来脊柱外科领域基础研究的热点，研究开发符合椎间盘结构与功能的移植物，对退变椎间盘进行功能重建，已成为治疗椎间盘退变性疾病比较理想的解决方案。

椎间盘包括软骨板以及位于软骨板之间的髓核和纤维环，髓核与纤维环是两个发育上和形态上分离的区域，在细胞和基质构成和作用方面各不相同。而目前组织工程椎间盘的研究主要采用单一成分的组织工程髓核或组织工程纤维环移植物，将两者复合构建组织工程椎间盘复合物是一个难点和关键点，主要体现在以下几个方面：1、如何选择符合髓核和纤维环生物学特性的生物材料，目前用于组织工程椎间盘研究的支架材料种类很多，但迄今仍没有具有优异生物学的类人体组织理想的替代和修复材料；2、如何在体外构建组织工程椎间盘复合组织，其中如何将组织工程髓核支架材料和纤维环支架材料复合并使复合组织具有更好的生物性能；3、种子细胞能否粘附纤维环支架内部并增殖和行使功能。

发明内容

本发明目的针对现有技术中仅有单一成分的组织工程髓核或组织工程纤维环移植物的缺陷，提供一种人工椎间盘复合体组织，其将髓核支架材料和纤维环支架材料复合在一起，且具有更好的生物学性能。

本发明所述人工椎间盘复合体组织，包括髓核和纤维环，其外层为纤维环细胞在脱矿脱细胞骨基质环生长构成的纤维环，内层为髓核细胞以及II型胶原、透明质、硫酸软骨素构成的髓核，是由髓核细胞及纤维环细胞在II型胶原、透明质、硫酸软骨素以及由脱钙脱细胞的骨基质环构成的纤维环复合体支架上生长形成。

作为优选，所述骨基质环为兔股骨髁部制备的骨基质环。

更优选地，所述髓核细胞及纤维环细胞来源于3周龄新西兰大白兔。

本发明还提供一种人工椎间盘复合体组织的构建方法，包含以下步骤：

步骤1：将除骨膜、除骨髓的兔股骨髁部，进行脱细胞脱钙处理后修整成形制备纤维环支架；

步骤2：将II型胶原和透明质酸按体积比9∶1混合注入步骤1制备的纤维环支架内，冷冻干燥后浸泡于pH为5.5含50-55mmol/l MES的40-45％乙醇溶液中30分钟后，浸泡于含50-55mmol/l MES、24-27mmol/l EDC、3-5mmol/l琥珀酰胺和2-3wt％硫酸软骨素的40-45％乙醇溶液中交联形成髓核纤维环复合体支架；

步骤3：使髓核细胞及纤维环细胞于所述髓核纤维环复合体支架内，加培养液培养。

作为优选，步骤1所述脱细胞采用Courtman的中性去污剂-酶四步脱细胞方法进行。

作为优选，步骤1所述脱钙为将兔股骨髁部在4℃0.6-0.8mol/LHCl中处理48-72小时。

作为优选，，步骤2所述交联为20-25℃下交联24-36h。

作为优选，步骤3所述培养液为pH7.4-7.6含10-15％FBS的DMEM/F12培养液。

作为优选，步骤3所述髓核细胞及所述纤维环细胞来源于3周龄新西兰大白兔，其浓度为1×10⁵-2×10⁵个/ml。