[发明专利]一种携带荧光素酶报告基因的HSV-1 BAC系统的构建方法

权利要求书

1.一种携带荧光素酶报告基因的HSV-1 BAC系统的构建方法，其步骤是：

A、构建HSV-1 BAC系统：

(1) 根据HSV-1 F株序列设计含HSV-1 UL37和UL38同源臂和BAC载体序列的引物，其序列为：

UL37 forward：TAggatccGAGCTGCAGCAGGCTGGAG；

UL37 reverse：CCGaagcttATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTGGCCG

TATAACACCC；

UL38 forward：CGCaagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATAAGTCCCGG

CATCCCGTTCG；

UL38 reverse：ATggatccGCCCAAACAGCCGCTCCAG；

(2) 构建转移载体pUSF6：

 a) 用高保真酶KOD以及上述引物使用PCR扩增UL37和UL38臂，分别用回收试剂盒回收；UL37臂 PCR产物经BamHⅠ酶切后试剂盒回收，pBluescript SK+（pBSSK）载体用BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切后试剂盒回收，上述片段经连接转化构建重组质粒pBSSK-UL37，然后用SacⅠ酶切后用T4 DNA聚合酶补平，然后用BamHⅠ酶切，回收后的片段与同样用BamHⅠ酶切后回收的UL38臂片段连接，构建pBSSK-UL37-UL38质粒；

b）BAC载体pUSF5用HindⅢ酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化；pBSSK-UL37-UL38质粒经HindⅢ酶切后，通过1.5%质量体积比的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，试剂盒回收UL37-UL38片段，与经CIP处理过的pUSF5载体进行连接，构建转移载体pUSF6；

  （3）构建HSV-1 BAC重组病毒：

a）将pUSF6用BamHⅠ线性化，试剂盒回收；

b） 取2 mg pUSF6用Lipofectamine 2000转染非洲绿猴肾细胞，然后用野生型F株HSV-1（wt HSV-1 F）进行感染，选择表达绿色荧光的噬斑即为重组型；

  (4) 重组病毒的噬斑纯化：

将绿色荧光的噬斑进行10、100、1000倍稀释后分别感染新鲜的单层Vero细胞，挑取只表达绿色荧光的噬斑，重复此过程2~3次直到最终病毒感染的细胞全部表达绿色荧光，为HSV-1 BAC；

  （5）重组病毒的鉴定：

以纯化的HSV-1 BAC重组病毒感染Vero细胞，提取病毒基因组，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行酶切鉴定；

（6）构建穿梭型的重组BAC： 

a) 扩增HSV-1 BAC重组病毒，测定病毒滴度，以10 m. o. i.的HSV-1 BAC病毒感染Vero单层细胞2~3 h后，刮取细胞，提取环状病毒基因组；

b) 环状病毒基因组经透析后，电转化到大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞中，均匀涂在12.5 mg/ml有氯霉素抗性的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜；

c) 挑取单个克隆，37 ℃培养过夜，碱裂解法小量提取BAC质粒，经HindⅢ酶切分析，选择与预期条带相符的克隆作为候选克隆，为pHSV-1 BAC；

(7) vHSV-1 BAC重组病毒的拯救：

a）按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒说明书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV-1 BAC质粒，最后用200 mL ddH₂O溶解；

b）取1~2 mg pHSV-1 BAC电转染到Vero细胞中，2~3天后观察到表达绿色荧光的噬斑，为vHSV-1 BAC；

（8）BAC骨架的切除：

取pHSV-1 BAC质粒1~2 mg与0.5 mg的Cre重组酶表达质粒pGS403同时电转染到Vero细胞中，2~3天后观察到同时有表达绿色荧光和不表达绿色荧光的噬斑，用步骤（4）所描述的噬斑纯化方法纯化出不表达绿色荧光的病毒，为HSV-1 lox；

（9）野生型及重组病毒生长特性的鉴定：

用噬斑检测法同时测定wt HSV-1、HSV-1 BAC、HSV-1 lox和HSV-1 BAC Luc病毒的一步生长曲线，结果各重组病毒和野生型病毒表现出几乎一致的生长曲线，表明BAC载体的插入并没有改变病毒的生长特性，这种构建的HSV-1 BAC系统进一步用来对病毒基因组进行改造或修饰；

B、构建Luciferase稳定表达的HSV-1 BAC系统：

（1） 设计扩增Luciferase-Hyg^r表达盒的PCR引物，引物5’端包含UL3与UL4基因间隔区的各40 bp的序列，用于同源重组，引物3’端包含Luciferase-Hyg^r表达盒19 bp的序列，用于扩增Luciferase-Hyg^r片段，其序列为：

Luc-Hyg forword：CCGAGATAACGTCATGCTGGCCTCGGGGGCCGAGTAACCGCGAGCTCTTACGCGTGCTA

Luc-Hyg reverse：

TGCCACCCCCCCTGCGGGCGGTCCATTAAAGACAACAAACTCAGGCGCCGGGGGCGGTG；

（2） 用高保真KOD酶以及上述引物PCR扩增Luciferase-Hyg^r片段，用回收试剂盒回收，回收后的片段用DpnⅠ消化后再次用试剂盒回收，双蒸水洗脱DNA片段；

（3） 将pHSV-1 BAC电转化到E. coli DY380中，32 ℃培养24~48 h，挑取单个克隆制备pHSV-1 BAC/DY380 电转化感受态细胞；

（4）取回收的Luciferase-Hyg^r DNA片段200 ng电转化到pHSV-1 BAC/DY380 电转化感受态细胞中，涂在氯霉素和潮霉素双抗性的LB琼脂平板上32 ℃培养过夜；

（5） 挑取单个克隆用PCR进行鉴定，对PCR阳性的克隆用碱裂解法提取BAC质粒，然后用HindⅢ进行酶切鉴定，与预期条带相符的克隆作为候选克隆，为pHSV-1 BAC Luc；

（6） 挑取pHSV-1 BAC Luc/DY380单克隆，每天传代一次，连续传代20天，在传代后的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天分别提取其BAC DNA用HindⅢ酶切后进行限制性片段长度多态性分析；

（7） 按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒说明书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV-1 BAC Luc质粒，取1~2 mg pHSV-1 BAC Luc质粒电转染到Vero细胞中，2~3天后观察绿色荧光噬斑的表达，为HSV-1 BAC Luc；

（8） 将HSV-1 BAC Luc重组病毒感染Vero细胞后，同时用噬斑检测法和荧光素酶检测试剂盒测定病毒的一步生长曲线，所构建的重组BAC系统用来在体外对病毒进行半定量。