[发明专利]一种携带荧光素酶报告基因的HSV-1 BAC系统的构建方法

说明书

技术领域

   本发明属于分子生物学与病毒学领域。更具体涉及一种新型的携带荧光素酶报告基因的HSV-1 BAC系统的构建方法。这种新型的HSV-1反向遗传操作系统可以用于在大肠杆菌内对病毒基因组进行快速、准确的改造，同时又可以方便快捷地在体外对病毒进行半定量，为进一步开展病毒功能基因组结构和蛋白质组学的研究、建立HSV-1基因治疗和高效疫苗病毒载体系统奠定了坚实的基础。

背景技术

疱疹病毒是一大类具有囊膜的双链线性DNA病毒，基因组大小约125～245 kb，能感染人类及多种动物。疱疹病毒科包括110多种病毒,根据其生物学特性及临床致病特点的不同可分为α、β、γ三个亚科。Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus Ⅰ，HSV-1)属于α亚科，具有较强的感染性。它有着独特的生活周期，感染后可在生物体内长期潜伏，终生存在，并能在一定的刺激条件作用下，由潜伏感染转入裂解性感染，导致疾病的反复发作，给患者生活及临床治疗带来了极大困难。治疗用药因耐药性问题日益显著，因而急需寻找开发新型的抗病毒药物和疫苗。而这个过程中对病毒分子生物学特性的研究是关键。

由于疱疹病毒基因组庞大（125～245 kb），过去往往对单个基因进行表达分析，虽然为基因在体内的功能研究提供了线索，但更深的了解仍然需要在病毒基因组中进行遗传分析。了解其复制和致病性分子特征的重要途径是，通过对感兴趣的基因进行定向突变产生有感染性的子代病毒，进一步研究这种突变对病毒表型的影响—即病毒学研究中的“反向遗传技术(reverse genetics)”。疱疹病毒的反向遗传技术在早期是应用常规的分子克隆技术，经过了需要辅助病毒参与、在真核细胞中重组并重建病毒的阶段，或使用重叠粘粒库转染细胞、重组构成疱疹病毒全基因组并产生子代病毒。其中，载体构建和重组病毒的筛选等工作费时又费力。随着大DNA片段克隆载体如酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)及相关操作技术的出现，疱疹病毒的遗传分析也发展到一个新的阶段，即在BAC基础上的全长基因组感染性克隆技术。该技术允许病毒基因组以BAC形式在大肠杆菌（E. coli）中保存、增殖和引入人工突变，BAC质粒转染到真核细胞即可重建病毒，经过复制的病毒可用于进一步的表型分析。这种在原核-真核细胞之间往返的操作系统构成一个穿梭系统，从理论上讲，它允许对病毒基因组中任何基因的任何遗传修饰。

BAC技术在α、β、γ 疱疹病毒亚科成员的基因组感染性克隆中都已获得成功，主要是应用于探索病毒的基因功能，可以用于研究病毒的复制、生长特性、致病性、病毒与宿主之间的关系如侵袭与免疫、潜伏感染、细胞嗜性、调节细胞信号功能等。通过构建重组病毒突变体将基因置于病毒基因组的背景中进行研究，是解析疱疹病毒功能基因组学、蛋白质组学和研究病毒感染和致病机理最有效的方法。传统的同源重组方法获得病毒突变株难度大、无法对必需基因进行缺失或者突变操作，因此将HSV-1全基因组克隆入细菌人工染色体，可以在大肠杆菌中开展病毒基因组的改造，提高构建重组病毒的效率，这将为HSV-1的基础和应用研究建立良好的技术平台。先前的研究已有一些HSV-1的BAC感染性克隆被报道，但有些由于BAC骨架的插入导致某些病毒基因被失活，有些又由于缺少合适的筛选标记使得后续的重组病毒的分离纯化变得困难。因而建立新型的、操作更为方便的重组BAC系统对于HSV-1的分子生物学功能研究具有非常重要的理论和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种携带荧光素酶报告基因的HSV-1 BAC系统的构建方法，方法易行，操作简便，该方法在系统中引入了绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光素酶（Luciferase）双报告基因，既能在体外方便地对病毒基因组进行修饰，又能方便地在体外对病毒粒子进行半定量，从而极大地简化了疱疹病毒的反向遗传学研究。

  为了实现上述的目的, 本发明采用以下技术方案:

  一种新型的携带荧光素酶报告基因的HSV-1 BAC系统的构建方法，它包含了GFP和Luciferase的双重报告基因，其构建可分为两个过程：首先将病毒基因组插入BAC载体构建重组BAC，然后将Luciferase导入重组BAC构建新型的含Luciferase的重组BAC。其步骤是：

   1、构建HSV-1 BAC系统：

其具体方案包括下列步骤：