[发明专利]高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO，其特征在于：该激动剂MAPO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO，其特征在于：该激动剂MAPO的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)设计并合成MPAPO基因：

采用3条引物两步法合成MPAPO基因：

引物F1：5’-GGT GGT CATATG CAT AGC GAT GGC ATT TTT ACC GAT AGC TAT AGC-3’；

引物F2：5’-TTT TTT CAC CGC CAG CTG TTT GCG ATA GCG GCT ATA GCT ATC GGT-3’；

引物F3：

5’-CCACCATGCTCTTCCGCA TTT TTT CAC CGC CGC CAG ATA TTT TTT CAC CGC CAG-3’

其中，GGT GGT或CCACCA为保护碱基，CATATG为NdeI酶切位点，TGCTCTTCCGCA为SapI酶切位点；

首先将引物F1和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以F1和F3为引物，PCR反应制得MPAPO基因；

(2)构建重组载体pKY-MPAPO：

用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pKYB和步骤(1)制得的MPAPO基因进行双酶切，再将双酶切后的MPAPO基因和双酶切后的质粒pKYB连接，得到重组载体pKY-MPAPO；

(3)制备表达工程菌pKY-MPAPO/ER2566：

用重组载体pKY-MPAPO转化表达大肠杆菌(Escherichia coli)ER2566，得到表达工程菌pKY-MPAPO/ER2566；

(4)表达和纯化：

①诱导表达工程菌pKY-MPAPO/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域组成的“三元”融合蛋白；

②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中，然后含有硫醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，诱导蛋白内含肽的N端切割反应；接着洗脱几丁质柱，得到目的多肽C端硫酯；透析目的多肽C端硫酯，得到稳定的水解产物；

③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述链延伸反应的条件为94℃，10min；降至58℃5min；72℃10min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述PCR反应的条件为反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

步骤(4)②中所述含有硫醇的溶液的组成如下：20mM Tris-HCI，0.5M NaCl，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH 8.0；

步骤(4)②中所述反应的条件为16℃反应24小时；

步骤(4)②中所述洗脱几丁质柱的溶液的组成如下：20mM Tris-HCl，500mMNaCI，1mM EDTA，pH 8.0。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

步骤(4)③中所述利用高效液相色谱技术纯化目的多肽的步骤如下：

A、流动相A为在体积百分比10％乙腈中添加三氟乙酸得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％乙腈中添加三氟乙酸，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1mL/min，20min线性梯度洗脱；

B、线性梯度洗脱中流动相B由0～60％(v/v)，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm。

8.一种高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO，由权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。