[发明专利]高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO及其制备方法，与其用于制备具有如下功能的药物：促进神经再生及神经损伤后修复，如：在角膜损伤后促进角膜神经突形成，促进角膜上皮细胞修复，以及提高角膜敏感性、改善泪腺分泌功能。

背景技术

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是1990年被发现由脑垂体分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP有两种存在形式：PACAP38，由38个氨基酸组成；PACAP27，由PACAP38氮端的27个氨基酸组成。PACAP通过激活其特异的G蛋白偶联受体，提高靶细胞cAMP等第二信使的浓度，从而发挥广泛而重要的生物学功能。PACAP有三类G蛋白偶联受体：PAC1、VPAC1和VPAC2；三类受体在生物体中分布不同，所起的作用也不相同。其中，PAC1受体是PACAP的特异性受体，主要存在于中枢神经系统、周围神经系统以及睾丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等腓神经组织中。PACAP与PAC1受体作用与腺苷酸环化酶(AC)和磷脂酶C(PLC)藕联：一是通过cAMP信号传导通路，激活AC，催化ATP转化为cAMP，cAMP随之激活其依赖性蛋白激酶A(PKA)，PKA可使细胞内多种蛋白质磷酸化，产生生理效应，尤其是在细胞的增殖分化中有重要作用；二是通过磷脂酰肌醇信号传导通路，首先与G-蛋白藕联并使之激活，在PLC作用下，磷酚肌醇二磷酸水解为肌醇三磷酸(IP3)和乙酰基甘油(DAG)，IP3的增加引起胞内钙离子释放，DAG则可激活蛋白激酶C(PKC)，PKC和钙离子-钙调蛋白依赖性的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶及酪氨酸激酶的激活，使胞内相应的蛋白质磷酸化，最终产生一系列生理效应。PACAP通过PAC1受体介导的生物学功能主要有：神经递质/调质、保护神经细胞；神经损伤修复；调节血管；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动，调节能量代谢平衡；参与调节免疫系统；调节细胞增殖分化等。

现有研究表明，PAC1受体在新生兔和成年兔的三叉神经节细胞中高表达，其mRNA的量约为VPAC1受体和VPAC2受体mRNA的25-31倍；PACAP可有效促进PC12细胞、脑神经及视网膜神经细胞突起形成和对抗神经细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)导致的大鼠海马神经元凋亡的作用。因此，研发作为PAC1受体特异激动剂的PACAP衍生多肽，具有重要的药用价值。

目前作为PAC1受体激动剂的野生型PACAP是由27个或38个氨基酸组成的多肽，野生型PACAP 27或PACAP 38在水溶液或体液环境中的稳定性较差，特别是一些酶如二肽基肽酶(DPPIV)还可降解其N端，从而使其失去与受体结合的活性。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有更高稳定性和更高生物活性的高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO。

本发明的另一目的在于提供所述高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO的制备方法。该制备方法根据PACAP衍生多肽MPAPO的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计MPAPO在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽MPAPO的高效制备；该制备方法生产效率高，生产成本低。

本发明的再一目的在于提供所述高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO，其氨基酸序列如下所示：MHSDGIFTDSYSRYRKQLAVKKYLAAVKK；

所述高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO的编码核苷酸序列为：

ATG CAT AGC GAT GGC ATT TTT ACC GAT AGC TAT AGC CGC TAT CGC AAA CAGCTG GCG GTG AAA AAA TAT CTG GCG GCG GTG AAA AAA；

所述高稳定性PAC1型受体特异激动剂MPAPO的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计并合成MPAPO基因：

采用3条引物两步法合成MPAPO基因：

引物F1：5’-GGT GGT CATATG CAT AGC GAT GGC ATT TTT ACC GAT AGC TAT AGC-3’；