[发明专利]用于分离纯化的RNA的试剂和方法

说明书

本申请为2006年12月1日提交的申请号为200580017853.5标题为“用于分离纯化的RNA的试剂和方法”的申请的分案申请

技术领域

本发明是关于改善从生物学样品中分离纯化的RNA的组合物和方法。

背景技术

纯的完整RNA的分离为分子生物学、临床和生物技术应用中分析基因表达的关键步骤。为实现上述目标，已经开发了多种RNA分离的方法。最经常使用的用于RNA分离的方法基于酚提取、从离液序列高的盐溶液中沉淀以及二氧化硅吸附(Ausubel等人，2002)，参阅申请人的专利US4843155、US 5346994和US 5945515。在US 4843155中描述的方法通常被称为单步(single-step)方法，用pH为4的酚-胍溶液(phenol-guanidinesolution)提取RNA。该方法的有效和简便使单步方法成为最常用的分离RNA的方法。

在申请人的US 5346994中描述的单步方法的改良方法允许通过pH为4-6的酚-胍溶液的提取，从同一样品中同时分离RNA、DNA和蛋白质。均质处理生物学样品，并且所得匀浆用诸如氯仿或溴氯丙烷的疏水有机溶剂进行相分离。然后离心，所得混合物分为含有RNA的上层水相、相的界面和含有DNA和蛋白质的下层有机相。收集所述水相，用醇沉淀并洗涤RNA。

在US 4843155和US 5346994中描述的单步方法中，小心收集分层的水相对分离RNA的质量很关键。少量的相的界面和有机相容易和水相一起转移，导致DNA和蛋白质污染分离的RNA。并且水相的收集要求手工处理，成为实现单步方法自动化的障碍。

US 4843155和US 5346994中描述的试剂和方法提供了基本纯的、未降解的RNA。然而根据US 4843155和US 5346994分离的RNA含有残留量(residual amount)的基因组DNA，可以通过反转录聚合酶链式反应测定法(reverse transcription-polymerase chain reaction assay，RT-PCR)检测。因此根据US 4843155和US 5346994分离出的RNA还必须进一步纯化使其不含DNA(Guan等人，2003；Girotti和Zingg，2003)。所述污染基因组DNA可以用作DNA聚合酶的母板(matrix)，产生另外的扩增产物并且扰乱RNA-依赖的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。RT-PCR中的DNA污染只能通过使用一组含有基因组DNA中外显子-内含子序列的引物而部分减轻，因为所述基因组DNA存在不含内显子的假基因(pseudogene)，使所述方法不可靠(Mutimer，1998)。

单步方法的改良已经改善了分离RNA的质量。在一种改良方法中，通过加入氯化锂的沉淀步骤移除RT-PCR抑制剂(Puissant，1990；Mathy，1996)。在另一改良方法中，在盐存在下以醇沉淀RNA增加了分离RNA的纯度(Chomczynski，1995)。然而，所述这些改良不能有效去除DNA污染。

去除污染DNA的共同惯例是用脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)处理含有RNA的样品。在DNA酶处理后，所述含有RNA的样品随后用酚和氯仿萃取。在一种为了限制DNA污染的尝试中，于单步方法中包括了附加的DNA沉淀步骤。通过添加三分之一体积的95％重量/重量乙醇，从水相中沉淀出所述污染的DNA(Siebert，1993)。乙醇的终浓度为约24％重量/重量。该文作者指出，在所述低的乙醇浓度下，DNA沉淀而RNA仍然存留在溶液中。RNA通过添加更多的乙醇从溶液中沉淀出来。然而，通过分析分离的RNA在琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色的可见DNA带以及RT-PCR证明，所述方法得到的RNA仍然受DNA污染。

在另一种为了减少DNA污染并改善单步方法中RNA的质量的尝试中，Monstein(1995)在一种繁复的方法中，将酚提取的pH值提高到4.1-4.7，并用蛋白酶K处理样品，然后再进行另一循环的酚提取、沉淀和醇洗涤。这一方法不仅耗时，而且仍然必需用DNA酶处理以得到备用于RT-PCR中的不含DNA的RNA。