[发明专利]一种奶牛隐性子宫内膜炎早期诊断试剂盒

权利要求书

1.一种奶牛隐性子宫内膜炎早期诊断试剂盒，其特征在于：它是利用SAA、IL-6和IL-8的标准抗体包被酶标板，用单克隆抗体作竞争抗体，用辣根过氧化物酶标记二抗，配制血清稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、H₂O₂、终止液，组装组成；

(一)SAA、IL-6和IL-8抗体的制备

(1)抗原的获得与动物接种

将E.coli进行原核培养，通过Ni柱分离纯化，然后用弗氏完全佐剂乳化的抗原在家兔的背部进行多点皮内注射，每点需要注射0.1ml左右，共注射0.5ml，2周后加强免疫；

(2)抗血清的采集和保存：耳缘静脉或耳动脉采血，以常规方法分离血清，将血清用0.45μm的滤器进行抽滤除菌，为了防止血清发生腐败，需在无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为0.02％，然后无菌条件下定量分装、冻干，贴上标签，存放于-80℃冰箱内备用；

(二)辣根过氧化物酶标记二抗制备

(1)羊抗兔IgG获得：无菌采健康兔心脏血，辛酸-硫酸铵法提取血清IgG，SephadexG25柱层析，SDS-PAGE电泳检测IgG纯度，透析袋浓缩，与福氏完全佐剂和不完全佐剂乳化后，免疫健康奶牛，10天后静脉采血，用同样方法纯化奶牛IgG；

(2)酶标记：使酶与戊二醛反应，除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基；

(3)酶标抗体结合物的纯化：50％饱和硫酸铵沉淀法；Sephadex凝胶过滤法；

(三)其他ELISA试剂的配制

(1)稀释液的制备

用于稀释高浓度的结合物以配成工作液，为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质如1％牛血清白蛋白，通过竞争以抑制结合物的吸附，一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05％的浓度较为适宜；

A液(NaH₂PO₄·2H₂O)2.34g/100ml，B液(NaHPO₄·12H₂O)5.37g/100ml；取A液2ml、B液8ml、NaCl3.18g、Triton×1000.75m，加双蒸水至150ml；

(2)洗涤液的配制

NaCO₃ 0.3g，NaHCO₃ 0.58g，加水至200ml，即可配成0.05mol/LpH9.6的磷酸盐缓冲液200ml；

NCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，Tween-200.5ml，BAS 1g加双蒸水至1000ml，即可配成0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液1000ml；

(3)显色液的配制

A液：19.2g柠檬酸钠加蒸馏水至1000ml，配成0.1mol/L柠檬酸钠溶液；

B液：Na₂HPO₄·12H₂O 71.7g加蒸馏水至1000ml；

临用前取A液24.3ml与B液25.7ml混合，加入联苯二胺20mg，待充分溶解后，加入30％的H₂O₂ 250μL，即可配成显色液；

(4)封闭液的配制

小牛血清5ml，0.01mol/L pH7.4PBS 95ml；

(5)终止液的制备

双蒸水200ml，浓硫酸34ml，缓慢滴加并不断搅拌，加至300ml蒸馏水即配成终止液；

(四)酶标板制作的工艺流程

(1)包被过程：无菌条件下，将所制备的SAA、IL-6和IL-8抗体用包被稀释液(0.05M pH9.6)的碳酸缓冲液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl，密封，4℃过夜；

(2)洗涤：弃去孔中液体，以0.01mol/L，pH值为7.4的PBST作洗涤液，加入足量室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次，拍干至无水印为止；

(3)封闭酶标反应孔：5％小牛血清置37℃封闭40min，封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后，甩去封闭液，加入足量洗涤液，室温作用3min，甩去，重复3遍，每次要吸干孔内的反应液，倾去液体后在吸水纸上拍干，重复3次；

(4)包装：将封闭好的酶标板放于铝箔袋中，加入1g包装的干燥剂，用真空包装机将酶标板包装好，贴上标签。