[发明专利]鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条

说明书

技术领域：

本发明涉及一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，属于一种新的动物诊断试剂，主要用来诊断鹅副粘病毒感染的动物；应用于畜牧兽医学领域。

背景技术：

鹅副粘病毒病是 1997 年我国新发现的一种在鹅群中具有高度传染性的病毒性传染病。鹅副粘病毒（Goose paramyxovirus）为血清Ⅰ型禽副粘病毒，属于副粘病毒科，副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属（Paramyxovirus），有囊膜，完整的病毒粒子近圆形，有时因囊膜破损而形态不规则。囊膜上的纤突长约8nm，在囊膜外呈放射性排列，具有能刺激宿主产生抑制红细胞凝集素和病毒中和抗体的抗原成份。病毒的核酸类型为单股RNA。根据B.Lomniczi等建立的基因分型方法，鹅源副粘病毒在基因分型上归属于基因Ⅶ型禽副粘病毒。鹅源副粘病毒病是现代化集约化养鹅业的主要疫病之一。在我国鹅源副粘病毒病发生和流行十分严重，每年的经济损失很大。该病在临床症状、病理变化方面与小鹅瘟有某些相似之处 ,发病率和死亡率较高 ,使养鹅业蒙受了较大的损失。

目前鹅副粘病毒病检测主要采用的技术方法有：HA、HI、ELISA、琼脂扩散试验、免疫荧光技术、RT-PCR、荧光RT-PCR以及病毒的分离鉴定等。比较快速准确的技术是ELISA和荧光RT-PCR，但这2种技术都需要特殊的仪器设备，并且检测时间都在2小时以上，检测成本昂贵，不便于适时和快速诊断。这些限制了鹅源副粘病毒病的预防控制，因此研制出一种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。

　 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其利用免疫学抗原抗体能特异性结合原理，胶体金标记单抗后与抗原结合，这种抗原抗体结合物再与另一株抗鹅副粘病毒单抗结合，形成夹心抗原抗体结合物在硝酸纤维素膜（NC膜）上出现颜色反应，可以肉眼观察；具有简单、快速、敏感和特异性好等特点。并且价格低廉，适用于基层或临床检测鹅副粘病毒病。

本发明的技术方案是这样实现的：一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于：试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8；硝酸纤维素膜上分别包被有抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9构成的检测线T线和兔抗Balb/c小鼠免疫球蛋白抗体IgG构成的质控线C线。

所述的结合垫上包被的胶体金标记的抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8的制备方法如下：首先制备抗鹅副粘病毒单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗鹅副粘病毒单克隆抗体3株，所制备单抗只针对鹅副粘病毒，且为鹅副粘病毒上的不同抗原表位，这就决定了试纸条的特异性；

（A）选用其中一株单抗标记胶体金，制备金标抗体，用0.1M碳酸钾调胶体金的PH值至8.2，按100ug抗体/毫升胶体金加入抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8,磁力搅拌器混匀30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。4℃ 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4℃备用。

（B）将结合垫浸泡于封闭液即2% BSA、0.5%吐温-20、2.5%蔗糖、0.05%叠氮钠、0.01M PBS中30分钟，37℃烘干；然后将制备好的金标抗体均匀喷涂于结合垫上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。