[发明专利]两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法

说明书

技术领域：

本发明属于天然植物提取技术领域，设计一种从两头尖中用高速逆流色谱法同时分离纯化竹节香附素A和两头尖皂苷D。

背景技术：

两头尖系毛茛科(Ranunculaceae)多被银莲花Anemone raddeana Regel的根茎。产于东北地区及山东等地，以吉林省产量最大。该药首载于明朝刘文泰所著《本草品汇精要》中，临床上有“祛风除湿，消痈肿”的作用，用于“风寒湿痹、四肢拘挛、骨节疼痛、疮痈溃烂”等症。

竹节香附素A(Anemodeanin A)和两头尖皂苷D(raddeanosede D)是两头尖的主要有效成分，均为三萜苷类化合物。具有较强的生理活性。林小钦等将不同质量浓度的竹节香附素A与HepG2细胞共同培养，采用MTT比色法及细胞集落形成法检测竹节香附素A对HepG2细胞生长、增殖的影响。结果竹节香附素A各剂量的作用与未处理组相比，在各时间点均有显著差异，从而得到结论：竹节香附素A对HepG2细胞增殖有明显抑制作用，在一定范围内随着试药质量浓度的升高和作用时间的延长而增强。两头尖皂苷D具有较强的抗癌活性。总皂苷能抑制癌的形成。皂苷D、F、H对人体致病的乙型链球菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡球菌等均呈现不同程度的抑菌作用，对醋酸所致小鼠痛觉反应，热刺激引起的疼痛均有镇痛作用。皂苷D对角叉菜胶所致肿胀有明显抑制作用，抑制强度高于总皂苷。两头尖总皂苷、皂苷D对正常小鼠自发活动有抑制作用，以皂苷D为最强。王明奎等用水解和溶剂萃取的方法从中药两头尖中提取制备了待测总皂苷(银莲花素A占总苷的20％)，并研究了总皂苷的体外和体内的抑瘤活性，发现制备的两头尖总苷具有较好的抑制肿瘤生长的活性，是一个有潜力的抗癌药物。

刘大有等已对两头尖进行了分离及结构鉴定，采用的为常压硅胶柱法，但其采用正丁醇萃取再上大孔树脂，正丁醇萃取率较低，保留成分损失较大。中国专利申请号200610124327.5采用水煎煮后，以乙醇为洗液用树脂柱吸附，制得的两头尖皂苷纯度仅为85％，但该方法引入碱液，易引起化合物化学性质的变化，使化合物不稳定并增加损失。

高速逆流色谱(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是国际上世纪80年代以来在液-液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，其分离原理是利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，达到稳定的流体动力学平衡态。HSCCC的流动相、固定相为互不相溶的液体。利用螺旋管柱方向性及特定的高速流星式旋转所产生的离心场作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在聚四氟乙烯管中，利用恒流泵连续输入流动相，随流动相进入螺旋柱的溶质再两相间持续分配，按分配系数大小依次洗脱。HSCCC具有以下优点：无不可逆吸附，聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体，可以消除气-液和固-液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，避免样品再分离过程可能存在的变性，适用于分离极性物质和生物活性物质；回收率高，由于液体作为流动相和固定相，滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收，能够同时完成分离纯化与制备，适于制备性分离；操作简单快捷，因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷；与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达数克，是HPLC的数百倍。与常压、低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个化合物，并且分离时间短，数小时即可完成。

发明内容：

本发明针对高含量竹节香附素A和两头尖皂苷D缺乏的问题，在已有研究基础上，采用高速逆流色谱技术从两头尖中分离制备出这两种活性成分。

本发明的目的在于提供一种两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法，利用该方法得到的竹节香附素A和两头尖皂苷D的纯度高达98％。

本发明提供的一种两头尖中两种单体化合物的分离纯化方法包括以下步骤：

1)取两头尖根茎，粉碎后用甲醇水溶液回流或冷浸提取，合并提取液，浓缩至总体积的1/10-6/10，低温放置，高速离心；

2)将离心所得沉淀物采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离系统由二氯甲烷、甲醇、正丙醇和水组成，其体积比为7-10∶12-15∶0.5-2∶4-8；

3)将溶剂系统置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，将步骤1)所得沉淀物溶于上下相的混合溶剂中，再使色谱柱中充满固定相，使主机转动，泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分。