[发明专利]一种酯酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的一种酯酶及其编码基因与应用。

背景技术

酯酶和脂肪酶都是羧酸酯水解酶，并且被分为8个族。酯酶(Esterases)水解少于10个碳原子的短链脂肪酸的酯键，而脂肪酶(Lipase)则水解多于10个碳原子的长链脂肪酸的酯键。酯酶和脂肪酶都是分解脂肪的酶，可利用底物范围非常广泛。目前，酯酶和脂肪酶被广泛用于洗涤剂行业、油脂化工、生物化工、食品工业、饲料行业、医疗医药、手性合成等行业中，每年全球需求量高达1000吨。

由于酯酶和脂肪酶的商业重要性，使得酯酶和脂肪酶的研究一直受到重视。微生物酯酶和脂肪酶具有比动植物酯酶和脂肪酶的作用pH范围、作用温度范围以及对底物的专一性类型更广，便于工业生产中获得高纯度制剂等优势，因此微生物酯酶和脂肪酶研究已成为世界各国新酶研发的重要来源。已报道的产酶微生物的种类非常广泛，主要包括青霉、白地霉、根霉、假丝酵母等属的真菌以及无色杆菌、不动杆菌、碱杆菌、节杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等属细菌。

尽管人们已从微生物中获得不少酯酶和脂肪酶，而且目前工业上应用的微生物酯酶和脂肪酶大多数都是采用传统的微生物纯培养的方法获得的，但是这种方式有很大的局限性。一方面，据估计自然界存在的各种微生物类群中获得纯培养的还不到1％，这使得只有很少一部分的微生物酯酶和脂肪酶得以研究利用，而近年来发展起来的宏基因组克隆技术使我们全面研究自然界广泛存在的未培养微生物的基因资源成为可能。另一方面，通过传统的微生物纯培养方法获得微生物酯酶和脂肪酶通常产量较低，而通过构建基因工程菌的方式发酵获得目的蛋白，其产量远非传统方式可比，最高能达到总蛋白量的50％。因此，采用宏基因组克隆等高通量筛选分子生物学技术开展微生物酯酶和脂肪酶的研究，对丰富微生物酯酶和脂肪酶家族成员，推动酯酶和脂肪酶的广泛应用都具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质，该蛋白质为酯酶。

本发明所提供的蛋白质，命名为Est01，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由1)衍生的蛋白质。

所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有酯酶活性蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有酯酶活性蛋白的DNA分子。

含有所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为将所述的编码基因插入载体pET30a的多克隆位点得到的重组载体。

所述重组菌为将所述的重组载体转入宿主菌E.coli BL2(DE3)得到的重组菌。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

所述蛋白质、所述编码基因、所述重组载体和/或所述重组菌在水解短链脂肪酸脂中的应用也属于本发明的保护范围。

所述水解的温度为10℃-60℃或10℃-40℃或10℃-30℃或20℃-40℃，优选为20℃；所述水解的pH值为5.0-10.0或7.0-10.0或8.0-10.0或8.0-9.0，优选为8.0。

所述短链脂肪酸脂为对硝基苯丁酸酯、对硝基苯乙酸酯、对硝基苯辛酸酯、对硝基苯癸酸酯和/或三丁酸甘油酯。

本发明应用宏基因组克隆技术获得的酯酶为能够水解短链脂肪酸的新型微生物酯酶，该酶在水解短链脂肪酸反应中的最适温度为20℃，最适pH值为8.0，最适底物为对硝基苯丁酸酯。本发明对利用宏基因组克隆技术开发获得新酶产品具有重要的意义。

附图说明

图1为含有酯酶基因阳性克隆的水解圈。

图2为PCR扩增酯酶基因est01的电泳结果。

图3为酯酶基因的诱导表达后的SDS-PAGE电泳结果。

图4为粗酶裂解液的平板定性检测酯酶水解活性的结果。