[发明专利]一种荧光探针和用该探针快速检测金黄色葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用免疫修饰的羧甲基壳聚糖/量子点对金黄色葡萄球菌进行特异性快速检测识别的方法，属再生资源化学生物学领域与环境卫生领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的人体致病菌，容易在人的鼻腔、皮肤和粘膜内繁殖，导致各种化脓性感染，如静脉炎、骨髓炎、心内膜炎，秘尿系统感染，医疗器械、手术感染，以及食物中毒和中毒性休克症。常规的金黄色葡萄球菌检测识别方法主要基于细菌培养与菌落计数，需要一周左右的时间才能完成。而在面临食品安全和环境安全的突发事件时，往往要求在现场或短时间内即完成对致病菌的识别检测。一些仪器的使用能够有效降低金黄色葡萄球菌的检测时间实现对金黄色葡萄球菌的快速特异性识别，如酶联免疫法(PCR)、RNA探针、飞行质谱，但所需仪器价格昂贵，对技术操作要求高，不利于普及。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种荧光探针，以及用该探针快速检测识别金黄色葡萄球菌的方法，该方法对在生物多糖基质中合成的水溶性荧光量子点进行免疫修饰，构建对金黄色葡萄球菌具有特异性识别能力的荧光探针，通过该荧光探针与细菌悬液的共培养和菌悬液荧光强度的测量来定量检测环境中的金黄色葡萄球菌。

本发明通过以下技术方案实现：

一种荧光探针，采用如下步骤制备：

(1)制备以羧甲基壳聚糖(CMCS)为模板的CMCS/QDs量子点水溶液，将该量子点水溶液置于透过分子量为10,000道尔顿的透析袋中对蒸馏水透析3天；

(2)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别溶解在蒸馏水中配成500mM～2μM(1M＝1mol/L)的EDC溶液和500mM～2μM的NHS溶液，免疫球蛋白人IgG溶解在蒸馏水中配成0.5～5mg/ml的人IgG抗体溶液；

(3)取纯化的CMCS/QDs量子点溶液3ml加入0.45ml的EDC溶液和0.12ml的NHS溶液的混合溶液中室温活化3～6h，向混合溶液中加入0.1ml人IgG抗体溶液，室温避光反应8～12h；

(4)将反应后的产物在葡聚糖凝胶柱上分离，用蒸馏水透析3～5天，在小于40℃的温度下浓缩，即得到CMCS-QDs-IgG荧光探针。

优选地，所述量子点(QDs，半导体纳米微晶)为CdS、ZnS、HgS、CdSe、ZnSe或HgSe。

优选地，所述量子点(QDs)的粒径为2～7nm。

优选地，所述CMCS/QDs量子点水溶液的制备方法为：将羧甲基壳聚糖在室温下溶解于蒸馏水配置浓度为2.5～10mg/ml溶液，搅拌条件下向其中加入5×10^-4～10^-2mol/l金属前驱物溶液(醋酸镉、醋酸锌、醋酸汞)，并搅拌8-12h获得羧甲基壳聚糖金属络合物。向络合物溶液中通氮气保护，在＞1000r/m的高速搅拌下迅速加入新鲜配置的硫族前驱物水溶液(硒化钠或硫化钠水溶液)，使得金属和硫的摩尔比为1∶3～3∶1之间，然后继续在氮气保护下将体系升温至80-100度回流2-3h，即获得高质量的羧甲基壳聚糖/量子点复合溶液；将上述产物在pH＝7.5的磷酸缓冲液中透析2天，凝胶过滤色谱柱纯化(柱填料为Sephedex G100)，浓缩得到的量子点水溶液。

一种用上述制备的荧光探针快速检测金黄色葡萄球菌的方法，具体步骤如下：

(1)接种单菌落待测细菌于5mL生理盐水中，制备三个平行样品；

(2)取900微升菌液加入100微升CMCS-QDs-IgG荧光探针，混和后37℃孵育30min；500rpm离心5～10min，去除上清后重悬于5ml、pH＝7.4的磷酸缓冲液，重复离心、洗涤，直至除去非特异性吸附的CMCS-QDs-IgG荧光探针；

(3)最后将细菌悬浮于5ml磷酸缓冲液中，测定菌悬液的OD500数值和450～650nm处的荧光强度。

优选地，所述测定菌悬液的荧光强度所用的荧光波长为量子点的特征发射波长。所述CdS量子点的特征发射波长为500nm，ZnS量子点的特征发射波长为450nm，CdSe量子点的特征发射波长为600nm。