[发明专利]一种毛细管整体柱及在固定化胰酶中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及功能材料及蛋白质高通量酶解，具体地说是一种毛细管整体柱及在固定化胰酶中的应用。

背景技术

在研究蛋白质组学的各种方法中，大部分都需要对蛋白质进行高效的酶解以便将蛋白质切割成适合CID[文献1.Jolene K.Diedrich and Ryan R.Julian.Anal.Chem.2010，82，4006-4014.，文献2.Kumaran Kandasamy，AkhileshPandey.Anal.Chem.2008，80，4825-4835.]，MALDI[文献3.Michel Salzet，and Isabelle Fournier.Anal.Chem.2009，81，8193-8202.]，ETD[文献4.JackSimons.Chemical Physics Letters.2010，484，81-95.]，等具有不同裂解方式的质谱分析和鉴定的肽段。因此，蛋白质酶解流程的优化成为一个热点领域，其中如何提高酶解流程的通量从而提高酶解的重复性，准确性以及实现在线化是这个领域的关键问题。最常用的方法就是将胰酶固定在各种材料上。纳米离子[文献5.Hubert H.Girault，and Baohong Liu.Molecular&Cellular Proteomics.2007，6，1428-1436.]、膜[文献6.Yan Li，and Cheng S.Lee.Anal.Chem.2003，75，1067-1074.]、整体柱[文献7.Gabriele Caccialanza，and Gabriella Massolin.Anal.Chem.2007，79，355-363.]等材料都可以用来实现胰酶的固定化。

目前，各种基质的整体柱被合成并用于胰酶的固定化。但是，酶解底物和产物在整体柱基质上的残留成为一个严重的问题，极大的干扰了整个分析流程的准确性和重复性。现行的方法是在整体柱基质的表面通过光聚合的方法涂上一层亲水的分子，例如，PEG[文献8.Timothy C.Logan andDouglas S.Clark.Anal.Chem.2007，79，6592-6598.；Nathan A.Lacher，andFrantisek Svec.Anal.Chem.2009，81，2004-2016.]，从而减少非特异性吸附的发生。聚(丙烯酰胺，N，N-双甲基丙烯酰胺)基质是一种亲水性、生物相容性较好的聚合物材料。在这里，通过热聚合方法和选择合适的单体聚合比例和致孔剂系统，在毛细管内发展一种制备聚(丙烯酰胺，N，N-双甲基丙烯酰胺)基质整体柱的新方法，并成功用于胰酶固定化从而实现酶解的高通量。

发明内容

本发明的目的在于在毛细管内制备一种以亲水性为特征的用于胰酶固定化的毛细管整体柱。

本发明借由以下技术措施实现：

一种毛细管整体柱，采用丙烯酰胺和N，N-双甲基丙烯酰胺两种功能单体，通过热聚合在刻蚀处理过的石英毛细管内通过原位共聚合制备成具有特定孔径范围的具有亲水表面的整体材料，整体材料孔表面经过转酰胺化处理后，得毛细管整体柱，其可以连接上胰蛋白酶，并作为微酶反应器使用。

所述的毛细管整体柱的制备是，将丙烯酰胺，N，N-双甲基丙烯酰胺，1，4-丁二醇，二甲基亚砜，十二醇和偶氮二异丁腈按照适当比例混合。随后将一部分溶液导入经过氢氟酸刻蚀的毛细管内。两端用硅胶封口并在水浴锅内反应一段时间。通过转酰胺化反应实现表面胺基活化。胰酶的固定化通过戊二醛耦联实现。

具体制备过程如下，

(1)预聚溶液的配置：20-40mg丙烯酰胺，20-60mg N，N-双甲基丙烯酰胺，100-400mg 1，4-丁二醇，100-500mg二甲基亚砜，100-250mg十二醇和0.5-3mg偶氮二异丁腈；

(2)整体材料的制备：

将预聚溶液超声后，通氮气去除溶液中的溶解氧；导入经过氢氟酸刻蚀的毛细管内，封口，并在60℃下，引发聚合，聚合时间2小时后用纯乙腈或甲醇和纯水分别冲出致孔剂；

(3)整体材料的修饰：

首先通过转酰胺化反应将惰性的酰胺键活化：将整体柱内充满98％的乙二胺，90℃反应3小时，最后用纯水和50mM碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净；

其次，在活化后的整体柱内通入25％戊二醛，在室温下反应6小时，随后用纯水和50mM碳酸氢铵缓冲液将剩余的乙二胺从整体柱内冲洗干净；得毛细管整体柱。

功能单体丙烯酰胺与N，N-双甲基丙烯酰胺的质量比为1∶1；