[发明专利]分析蛋白的抗原表位的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析蛋白的抗原表位的方法。

背景技术

宿主的抗体反应在抵抗病原体感染的过程中起着重要作用，而体内的多克隆抗体反应是由针对不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的单克隆抗体组成的。深入的理解这个复杂的过程能够为研究疾病的发病机制提供关键的信息，还能够为高效疫苗的研发和疾病治疗提供重要的理论基础。

在抗原表位的诸多研究方法中，兴起于1990年的噬菌体展示肽库技术(Scott，J.K.and G.P.Smith，Searching for peptide ligands with an epitope library.Science，1990.249(4967)：p.386-90.)，即用随机合成的短肽文库(一般6-12个氨基酸，库容量达10¹¹-10¹²)和噬菌体展示系统进行筛选的方法，以其快捷、准确、不受氨基酸位点限制的优点而逐渐成为目前应用最广、发展最快的抗原表位筛选平台之一。然而，噬菌体展示肽库技术也存在很大的局限性：(1)短肽文库可以产生的绝大部分是线性表位，不能很好地模拟占抗原表位80％以上的构象型表位；(2)噬菌体的衣壳蛋白所能容纳的外源分子小、结构简单，对外源蛋白缺乏修饰，该系统中很多细胞毒性分子和真核生物蛋白难以表达和展示；(3)噬菌体个体过小，多采用亲合层析柱或亲合聚苯乙烯板进行筛选，筛选效率低；(4)每轮筛选后，噬菌体必须重新感染宿主细胞以便获得足够的病毒粒子进行下一轮筛选，重组病毒粒子间感染能力的差别会造成一定的扩增优势；(5)噬菌体易被空气传播，因而容易引起交叉污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种分析蛋白的抗原表位的方法。

本发明提供的分析蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤：

(1)构建目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；

(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；

(3)将目的蛋白的抗体与酵母展示文库混合，分选出与抗体结合的酵母；

(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核苷酸序列分析蛋白的抗原表位(包括线型表位和构象型表位)。

所述T载体为在pCTCON2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTCON2-T质粒；所述目的蛋白的DNA片段插入所述pCTCON2-T质粒的Xcm I酶切位点。

所述酵母为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。

所述方法中，可利用流式细胞术(FACS)进行步骤(3)中的所述分选。

步骤(2)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面包括如下步骤：

①提取所述DNA文库的质粒转化所述酵母，得到重组酵母；

②收集重组酵母诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。

所述诱导培养的参数具体可为：采用SGCAA培养基，20℃、250rpm摇床中培养36小时。SGCAA培养基的配方具体为：半乳糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，NaHPO₄·12H₂O 13.6g，NaH₂PO₄·H₂O 8.56g，加重蒸水至1L。

构建所述DNA文库的方法包括如下步骤：

(1)将目的蛋白的编码基因用DNase I进行消化，回收50-100bp的DNA片段；

(2)将步骤(1)回收的DNA片段进行随机片段重组；

(3)将步骤(2)重组后的DNA片段加A尾；

(4)将加A尾后的DNA片段插入所述pCTCON2-T质粒的Xcm I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA文库。