[发明专利]一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒及鉴定方法

权利要求书

1. 一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒，其特征是，所述试剂盒由下列部件组成：

（1) RNA提取A液，内装Trizol液；

（2) RNA提取B液, 内装苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的体积比为25：24；

（3) RNA提取C液, 内装异丙醇；

（4) RNA提取D液, 内装75%乙醇；

（5) RNA提取E液, 内装DEPC处理后高温灭菌的超纯水；

（6) RT反应F液，内装反应缓冲液Buffer、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑制和反转录酶M-MLV，各组分的体积配比为：

反应缓冲液（5×Bbuffer）         2份

dNTP                           1份

oligo dT引物                     1份

RNA酶抑制                     0.3份

反转录酶M-MLV                 0.5份

DEPC处理的超纯水                4.2份；

（7) RT-PCR反应G1液, 内装含Mg²⁺的反应缓冲液Buffer、dNTP、Taq酶、正向引物F和反向引物R，各组分的体积配比如下：

含mg²⁺的反应缓冲液（10×Bbuffer） 2份

dNTP                            0.3份

正向引物F                        1份

反向引物R                        1份

超纯水                          13.3份

Taq酶                           0.4份；

（8) RT-PCR反应G2液, 内装含Mg²⁺的反应缓冲液，dNTP、Taq酶、内参基因Actin的正向引物ACTF和内参基因Actin的反向引物ACTR，各组分的体积配比如下：

含mg²⁺的反应缓冲液（10×Bbuffer） 2份

dNTP                            0.3份

正向引物ACTF                    1份

反向引物ACTR                    1份

超纯水                          13.3份

Taq酶                           0.4份；

（9) 阳性对照H1液，内装黑籽油菜阳性模板；

（10)阴性对照H2液，内装黄籽油菜阴性模板。

2.根据权利要求1所述的油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒，其特征是，所述正向引物F序列为：5'-TCAGCTGCTGCGGTTTCTATC-3'，所述反向引物R序列为：5'-CAGATAGCTTCTGCATTTCCTTG-3'；所述正向引物ACTF序列为：5'-GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3'，所述反向引物ACTR序列为：5'-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3'。

3.一种利用权利要求1所述试剂盒鉴定油菜发育极早期种皮颜色的方法，其特征是，按以下步骤进行：

（1）取待测的开花4-5天后的去掉种脐的种皮样品，加5倍体积的RNA提取A液，冰浴匀浆，室温静止2-5min，得匀浆液；

（2）在上述匀浆液中加入0.5倍体积的RNA提取B液，混匀，静止2-5min；

（3）4-10℃, 12000g离心5min；

（4）取上清液，加入1倍体积的RNA提取C液，混匀，静置5-10 min；

（5）4-10℃,12000g离心5min；

（6）弃上清，用RNA提取D液洗涤后，室温干燥或在超净台中吹干，加RNA提取E液溶解，得RNA溶液；

（7）取所得RNA溶液，加入4倍体积的RT反应F液，42℃保温30 min，然后99℃处理5 min，得RT-PCR的模板；

（8）将RT-PCR的模板、阳性对照H1液、阴性对照H2液分别加到RT-PCR反应G1液和RT-PCR反应G2液中，混匀后至于PCR仪上；

（9）进行PCR扩增：先94℃ 3min，再94℃, 30s; 58℃, 30s; 72℃, 30 min, 30个循环后，72℃延长6 min，反应结束后，得扩增产物；

（10）取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液（含溴酚蓝），经1%的琼脂糖凝胶电泳15-30min后在紫外仪上观察，若与阳性对照同一位置的319 bp处出现明亮的条带，则为检测阳性，说明该待测样品种子成熟后种皮为黑色，否则为阴性，说明该待测样品种子成熟后种皮为透明，种子表现出胚的黄色。