[发明专利]一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说是涉及一种油菜种子发育极早期种皮颜色快速鉴定试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

国内外大量研究表明，在相同遗传背景下，黄色种皮油菜（简称黄籽油菜）与黑色种皮油菜（简称黑籽油菜）相比具有种皮薄、含油量高、油中色素和杂质少、木质素含量低等优点。油菜黄籽一直是油菜育种家们最关心的问题，尤其是对种子黄籽性状的极早期选择（开花后10天内），但油菜种子颜色要到成熟是才能显现出来，以前方法很难做到这一点。无论是黄籽还是黑籽在种子发育的极早期，种皮都是绿色的，育种者在种子发育的极早期不能对种皮颜色进行选择，需要在种子成熟后才能对种皮颜色性状进行选择。同时，在油菜杂种优势利用中，根据杂交亲本之间的种皮颜色的显隐性关系，在种子发育极早期对杂交种的亲本和杂交种的纯度进行鉴定。通常要鉴定油菜种皮颜色，都要等到种子成熟后才能判断，虽然我们曾用化学鉴定法（香草醛染色法）能够鉴定油菜种皮的颜色，但至少要在授粉10天后才能判断，如果能够在开花后10天内就能对种皮颜色进行鉴定，那可以大大减少油菜黄籽育种的工作量，这样可以加快育种的进程，降低了育种成本，因此油菜种子种皮颜色发育极早期的快速鉴定试剂盒及鉴定方法对于油菜育种有极其重要的意义。

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，即PCR），是目前最流行的体外扩增DNA片段的技术，具有快速、敏感和特异性强等特点，如能将该技术用于油菜种皮颜色的极早期鉴定，将具有重要的意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的种皮颜色极早期鉴定上存在的不足，提供一种快速、特异性好、灵敏度高的油菜种子发育极早期（开花后4-5天）快速鉴定种皮颜色的试剂盒，以便应用于油菜的育种；本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒鉴定油菜发育极早期的种皮颜色的方法。

一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒，其特征是，所述试剂盒由下列部件组成：

（1) RNA提取A液，内装Trizol液；

（2) RNA提取B液, 内装苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的体积比为25：24；

（3) RNA提取C液, 内装异丙醇；

（4) RNA提取D液, 内装75%乙醇；

（5) RNA提取E液, 内装DEPC处理后高温灭菌的超纯水；

（6) RT反应F液，内装反应缓冲液Buffer、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑制和反转录酶M-MLV，各组分的体积配比为：

反应缓冲液（5×Bbuffer）         2份

dNTP                           1份

oligo dT引物                     1份

RNA酶抑制                     0.3份

反转录酶M-MLV                 0.5份

DEPC处理的超纯水                4.2份；

（7) RT-PCR反应G1液, 内装含Mg²⁺的反应缓冲液Buffer、dNTP、Taq酶、正向引物F和反向引物R，各组分的体积配比如下：

含mg²⁺的反应缓冲液（10×Bbuffer） 2份

dNTP                            0.3份

正向引物F                        1份

反向引物R                        1份

超纯水                          13.3份

Taq酶                           0.4份；

（8) RT-PCR反应G2液, 内装含Mg²⁺的反应缓冲液，dNTP、Taq酶、内参基因Actin的正向引物ACTF和内参基因Actin的反向引物ACTR，各组分的体积配比如下：

含mg²⁺的反应缓冲液（10×Bbuffer） 2份

dNTP                            0.3份

正向引物ACTF                    1份

反向引物ACTR                    1份

超纯水                          13.3份