[发明专利]一种弓形虫快速检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种弓形虫快速检测试剂盒，包括2×LAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H₂O，其特征在于所述引物混合物包括：40pmol上游内部引物FIP、40pmol下游内部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、5pmol下游外部引物B3、20pmol上游环形引物LF及20pmol下游环形引物LB。

2.根据权利要求1所述的弓形虫快速检测试剂盒，其特征在于针对弓形虫三磷酸核苷水解酶基因设计引物，所述引物序列为：

上游内部引物FIP(F1c+F2)：

5′-ACCTAGCTGGGTCTTCGCCTAG-TTTT-GCCTCTTCGCGTTTATCACG-3′

下游外部引物BIP(B1c+B2)：

5′-AATACGGGGTGAAGCATTGCCG-TTTT-AGAAGCACCCCCAACCTC-3′

上游外部引物F3：5′-CGATCACAGGAGCTGAGGA-3′

下游外部引物B3：5′-CGGTACCTTCCTGTAGTGGA-3′

上游环引物LF：5′-AAAGAGGGCGTCGCGGTAC-3′

下游环引物LB：5′-GAGGAAGGCCTCTTCGCGTTTATC-3′

3.根据权利要求1所述的弓形虫快速检测试剂盒，其特征在于所述2×LAMP反应液包括4％pH8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO₄、20mM(NH4)₂SO₄、0.2％Tween 20、2.8mM dNTPs和1.6M甜菜碱。

4.一种根据权利要求1所述弓形虫快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于按下述工艺方法制备：

a、制备2×LAMP反应液：①配置Tris-HCl：配置浓度为12.11％Tris，并用HCl调节pH8.8，备用；②配置含有终浓度为22.2mM的KCl、17.8mM的MgSO₄、22.2mM的(NH4)₂SO₄和1.78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0.22％Tween20和4.4％的Tris-HCl，备用；③将②中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9∶1的比例混合；

b、制备引物混合物：①针对弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的一段高度保守的区域设计引物；②混合引物中FIP∶BIP∶F3∶B3∶LF∶LB为8∶8∶1∶1∶4∶4，按照如上体积比例混匀。

c、制备标准阳性模板：①20～25克体重小鼠每只按1×10⁵～1×10⁶弓形虫速殖子腹腔接种，经3～4日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70～75％酒精内体表消毒；②每只小鼠用2毫升PH7.2PBS缓冲液冲洗腹腔收集虫体；③提取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。