[发明专利]一种弓形虫快速检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测弓形虫基因组DNA的环介导等温扩增技术，具体说是一种弓形虫快速检测试剂盒，本发明包括该试剂盒的制备方法。

背景技术

目前常用的诊断弓形虫病的方法包括凝集试验、酶联免疫吸附法和PCR等，这些方法都有一定的缺点。凝集试验主要是间接血凝法，该方法的缺点是检测灵敏度低，会出现漏检的情况；酶联免疫吸附法的缺点是所需的仪器设备昂贵，需要配合使用专门的酶标仪、操作过程相对复杂、检测时间比较长；而且这两种方法是针对弓形虫抗体检测，检测为阳性的动物可能是接种弓形虫疫苗引起的。PCR和LAMP方法都是基于分子生物学基础上的灵敏、特异、高效新型诊断技术。但PCR方法需要昂贵的PCR仪来配合使用，反应的时间长，反应后需要进行琼脂糖凝胶电泳用凝胶呈像仪观察结果，且在动物基因组DNA提取过程中，可能会有一些遗留的PCR反应的抑制因子影响其特异性和敏感性。

发明内容

本发明的目的是为了克服当前弓形虫病诊断技术中的不足，提供一种基于分子生物学领域的的高敏感性、高特异性、高效性、操作简单的弓形虫快速检测试剂盒，同时提供该试剂盒的制备方法。

一种弓形虫快速检测试剂盒，包括2×LAMP反应液、引物混合物、大片段链置换DNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H₂O。所述引物混合物包括：40pmol上游内部引物FIP、40pmol下游内部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、5pmol下游外部引物B3、20pmol上游环形引物LF及20pmol下游环形引物LB。

所述引物针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计，引物序列为：

上游内部引物FIP(F1c+F2)：

5′-ACCTAGCTGGGTCTTCGCCTAG-TTTT-GCCTCTTCGCGTTTATCACG-3′

下游外部引物BIP(B1c+B2)：

5′-AATACGGGGTGAAGCATTGCCG-TTTT-AGAAGCACCCCCAACCTC-3′

上游外部引物F3：5′-CGATCACAGGAGCTGAGGA-3′

下游外部引物B3：5′-CGGTACCTTCCTGTAGTGGA-3′

上游环引物LF：5′-AAAGAGGGCGTCGCGGTAC-3′

下游环引物LB：5′-GAGGAAGGCCTCTTCGCGTTTATC-3′

所述2×LAMP反应液包括4％三羟甲基氨基乙烷(Tris-HCl，pH8.8)、20mM氯化钾(KCl)、16mM硫酸镁(MgSO₄)、20mM硫酸铵((NH4)₂SO₄)、0.2％吐温20(Tween20)、2.8mM脱氧核苷酸混合物(dNTPs)和1.6M甜菜碱。

所述弓形虫快速检测试剂盒的制备方法如下：

(1)制备2×LAMP反应液：①配置Tris-HCl：配置浓度为12.11％Tris，并用HCl调节pH8.8，备用；②配置含有终浓度为22.2mM的KCl、17.8mM的MgSO₄、22.2mM的(NH4)₂SO₄和1.78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0.22％Tween20和4.4％的Tris-HCl，备用；③将②中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9∶1的比例混合；

(2)制备引物混合物：①针对弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的一段高度保守的区域设计引物；②混合引物中FIP∶BIP∶F3∶B3∶LF∶LB为8∶8∶1∶1∶4∶4，按照如上体积比例混匀。

(3)制备标准阳性模板：①体重为20～25g小鼠每只按1×10⁵～1×10⁶弓形虫速殖子腹腔接种，经3～4日，小鼠出现精神沉郁、不食、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70～75％酒精内体表消毒；②每只小鼠用2毫升PH7.2PBS缓冲液冲洗腹腔收集虫体；③提取弓形虫基因组DNA，此为标准阳性模板。

反应体系为50％2×LAMP反应液、3.6％引物混合物、0.4％BstDNA聚合酶、8％标准阳性模板以及34.4％dd H₂O。反应条件为65℃，30min；80℃，2min；4℃，永久保存。反应后按体积比为25∶1将LAMP产物与显色剂混合，观察颜色变化，判断结果。