[发明专利]检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于LNA和MGB修饰的短探针单重和双重荧光RT-PCR检测核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于不同动物组织样本中H1和H3亚型流感病毒的准确检测，还可适用于不同动物活体样本(主要为拭子样品)H1和H3亚型流感病毒的检测，可用于动物H1和H3亚型流感病毒的筛查，出入境检疫等，属于检验检疫领域。

背景技术

自1934年首次分离出甲型流感病毒以来，由H1或H3亚型的流感病毒已引起多次世界性的人和动物的大流行以及大流行间期的小流行。H1和H3亚型流感病毒感染宿主范围广，主要感染宿主包括人，禽，猪、马以及其他多种动物。而且其中一些毒株具有在多种动物间传播的能力，例如引起人类历史上多起大流感流感的病原均可在人、猪之间传播。从1989年和1990年发生于我国的马流感疫情中分离出的H3N8亚型的马流感毒株(A/马/吉林/1/89)，该毒株的6个基因片段为禽源片段。2009年全球大流行的甲型H1N1流感病毒是一个新型流感变异株，目前研究已经证明该毒株可自然感染猪、犬猫等哺乳动物。

目前采用TaqMan探针荧光RT-PCR对流感病毒H1和H3亚型进行快速分型检测已经成为目前流感病毒快速检测筛查的首选方法。但TaqMan方法一般要求探针Tm值明显高于引物Tm值，因此在设计引物探针时探针序列往往较长。但对于流感病毒，不同感染宿主的病毒序列之间以及新型变异毒株与经典毒株的HA序列存在很大差异，这使得很多采用长探针的H1和H3核酸检测方法在检测不同来源的H1和H3亚型病毒方面受到局限。

采用短探针可有效解决毒株变异导致的H1和H3亚型流感病毒分型方法通用性较差的问题。

但采用短探针必须在不改变序列的情况下提高探针的Tm值。近期，锁核酸(locked nucleic acid，LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在生物学研究领域引起了人们的广泛关注，它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(ΔTm＝3～8℃)，具有抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。

在通过对不同来源的H1亚型流感病毒的HA基因进行序列比对的基础上，发现H1亚型流感病毒HA基因尾部存在12nt的保守区，适合通过LNA修饰后作为短探针用于荧光RT-PCR检测。

但在对H3亚型流感病毒的HA基因进行序列比对时，发现可以利用14nt简并短探针建立荧光RT-PCR方法，由于存在兼并碱基，因此采用在探针3′修饰MGB(Minor Groove Binder)来提高探针的Tm值。

本发明首次将单重和双重基于LNA和MGB的短探针荧光RT-PCR技术应用于H1和H3亚型流感病毒检测，提供了针对H1和H3亚型流感病毒的基于LNA和MGB的短探针、简并引物和试剂盒。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测针对H1和H3亚型流感病毒核苷酸序列，包括引物序列和基于LNA和MGB的短探针序列。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测H1和H3亚型流感病毒的单重和双重检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择H1和H3亚型流感病毒HA基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在12～14个碱基左右，采用LNA或MGB修饰，并标记荧光基团。

1组检测流感病毒H1亚型的核苷酸序列，如下：

1)5’-CAG ATT YTG GCG ATC TAY TC-3′(SEQ ID NO：1)

2)5’-GAC CCA TTA GAR CAC ATC CAG-3’(SEQ ID NO：2)

Y代表嘧啶，此处为T或C；R代表嘌呤，此处为A或G；