[发明专利]一种快速高通量生产重组蛋白的平台

权利要求书

1.一种快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建含有编码EBN病毒的EBNA基因OriP复制子的重组载体；

2）将重组载体转化入CHO-K1细胞菌株中，筛选得到稳定表达EBNA蛋白的CHO-K1细胞株；

3）在培养基中培养CHO-K1细胞株，并用0.2～0.5X10⁶个细胞/mL的接种密度扩大至多联反应器的细胞发酵罐中，搅拌转速维持80rpm,溶氧控制下限30～40%，温度34～37度，pH维持6.8～7.2，进行培养；

4）将培养至细胞密度为0.8～1.2X10⁶个细胞/mL的CHO-K1细胞株进行转染；

5）将转染试剂与1～5μg的带有目的基因的质粒混合，震荡摇匀后，于室温孵育5～15分钟，转入细胞培养物，同时于20～50rpm的低转速培养2小时后，再上升到60～120rpm的转速培养；

6）培养5～7天后收集并纯化，同时准备下一批转染直到所有3批结束，将收集的3批纯化合并；

7）用Elisa鉴定收集纯化的细胞培养物上清或细胞裂解物得到表达产量，并用亲和层析纯化方法纯化，得到产物蛋白。

2.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤1）中的重组载体为pcDNA3.1载体。

3.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤3）中的培养基为无血清培养基。

4.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤3）中的多联反应器的细胞发酵罐为8联罐，所述细胞发酵罐的体积为0.5～2L。

5.根据权利要求4所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤3）中的多联反应器还设有控制单元、主机和罐体集成平台，所述控制单元对细胞发酵罐进行数据传输，所述控制单元至少设有一个，所述主机用于对控制单元进行数据传输，所述罐体集成平台用于支撑细胞发酵罐。

6.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤3）中的所述CHO-K1细胞株的接种为0.2X10⁶个细胞/mL，溶氧控制下限为30～35%，pH为6.8～7.0。

7.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤4）中PEI储液的浓度为1mg PEI/mL，由25Kda的线性聚阳离子PEI与多肽以1：1的摩尔比混合而成，所述多肽的序列为序列表中SEQ ID NO:1的序列。

8.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤4）中培养至细胞密度为0.8～1.2X10⁶个细胞/mL的CHO-K1细胞株待转染。

9.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤步骤5）中将转染试剂与2.5μg的带有目的基因的质粒混合，震荡摇匀后，于室温孵育10分钟，转入细胞培养物，同时于20～50rpm的低转速培养4小时后，再上升到60～100rpm的转速培养。

10.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的平台，其特征在于，所述步骤步骤6）中三批转染完成所有的时间为20～30天。