[发明专利]一种快速高通量生产重组蛋白的平台

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白生产平台，尤其涉及一种快速高通量的生产重组蛋白的平台，属于基因工程领域。

背景技术

基因工程蛋白的表达从上世纪80年代在国外兴起，迄今已经接近30年，并被广泛应用于生物学研究、医药研究与生产及化妆品保健品行业。尤其由于生物医药行业特别是以治疗单抗为产品的生物技术公司在90年代后异军突起，使得该行业每年以超过50%的复合增长率高速发展。随着本世纪初，人类基因组计划的成功完成，人们的目光迅速转移到各个功能基因的研究，在这些功能基因中占绝大部分均为蛋白表达序列。后基因组时代，各个研究机构、生物制药公司将要对成千上万的蛋白进行功能研究和筛选，但这么多蛋白又不可能在短时间内完全由单个独立的单位来完成，因此也孕育了一个巨大的为生物制药公司和研究单位提供这方面服务的市场。每个蛋白都需要毫克到克级水平，同时又要具有与天然蛋白几乎完全一样的功能和结构，所以谁能够在短时间内具有更大的生产能力无疑就是这个市场的胜利者。在这个方面最近几年一直有更新的技术出现。据美国有关机构估计，该市场在未来5年将从目前的30亿左右猛增至50-55亿美金，市场复合增长率在50-60%间。

国内做蛋白表达服务的公司与平台很多，但大多数均基于以大肠杆菌为代表的原核生物作为宿主来表达，得到的蛋白没有糖基化修饰以及可能的结构丧失，从而使蛋白产物没有或很少活性；还有少数公司以细胞表达作为平台，但由于没有高效的表达载体以及合适的细胞株，培养基和设备系统，通常得到克级的蛋白需要耗费数月时间与数十万资金。国外在最近几年随着动物细胞培养与表达技术的发展，已经出现了以Life Tehnologies 公司为代表的一些试剂公司开发出用于快速生产以哺乳动物细胞为宿主表达重组蛋白的表达载体，CHO及293细胞株及培养基，但最高表达量在30-50mg/L之间徘徊，并且其培养基及转染试剂极其昂贵。其他公司大多以293细胞为主，存在一定的局限性，主要表现为70%以上的医药公司均选择CHO为宿主用于治疗蛋白生产，也就是说以293细胞为宿主表达的蛋白作功能研究的起点，由于其糖基化修饰和CHO细胞的差异依然存在误导结果可能。

实用新型内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种快速高通量的重组蛋白的平台，以使生产的重组蛋白达到毫克到克级的水平，生产方法快速、高通量，节约成本，并且效率高、结果准确。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种快速高通量生产重组蛋白的平台，包括以下步骤：

1）构建含有编码EBN病毒的EBNA基因OriP复制子的重组载体；

2）将重组载体转化入CHO-K1细胞菌株中，筛选得到稳定表达EBNA蛋白的CHO-K1细胞株；

3）在培养基中培养CHO-K1细胞株，并用0.2～0.5X10⁶个细胞/mL的接种密度扩大至多联细胞发酵罐中，搅拌转速维持80-100rpm，溶氧控制下限30～35%，pH维持6.8～7.2，进行培养；

4）将的CHO-K1培养至细胞密度为0.8～1X10⁶个细胞/mL 等待转染；

5）将转染试剂PEI与1～5μg的带有目的基因的质粒混合，震荡摇匀后，于室温孵育5～15分钟，转入细胞培养物，同时于20～50rpm的低转速培养3～6小时后，再上升到60～100rpm的转速培养；

6）培养5～7天后收集并纯化，同时准备下一批转染直到所有3批结束，将收集的3批纯化合并；

7）用Elisa鉴定收集纯化的细胞培养物上清或细胞裂解物得到表达产量，并用亲和层析纯化方法纯化，得到产物蛋白。

所述目的基因质粒按常规分子生物学方法获得。

本发明的有益效果是：转染并随机整合了EBV病毒蛋白编码基因，使细胞内含OriP的动物细胞表达载体复制2～3代，增加了1倍以上的表达时间；采用多联细胞发酵罐提高了通量，能够快速高通量地生产毫克到克级的蛋白，并且效率高，结果准确。

在上述技术方案的基础上，本实用新型还可以做如下改进。

进一步，所述步骤1）中的重组载体为pcDNA3.1载体。

进一步，所述步骤3）中的培养基为无血清培养基。

采用上述进一步方案的有益效果是：无血清，非动物源性可达到1X10⁷cells/mL的细胞密度和峰值80mg/L在CHO-K1细胞中的表达量，增加了产量为普通培养基的2～5倍，同时去除了转染后换液的步骤。