[发明专利]一种减少L-亮氨酸发酵过程中副酸的方法

说明书

【技术领域】：本发明涉及一种减少L-亮氨酸发酵过程中副酸的方法，本发明属于生化工程领域。

【背景技术】：黄色短杆菌是工业发酵生产L-亮氨酸的常用菌株。在L-亮氨酸生产过程中HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸是主要的副酸，这些副酸的大量积累严重抑制菌体活力，使亮氨酸产量下降，同时这些副酸的存在也对亮氨酸的分离提取造成不利影响。

近年来，代谢工程领域的研究结果表明，丙酮酸和乙酰辅酶A是黄色短杆菌合成L-亮氨酸代谢网络的关键节点，另外HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸是L-亮氨酸分批发酵过程的主要副产物。当EMP流量超出TCA及L-亮氨酸生物合成途径的代谢能力时，丙酮酸代谢受阻，从而通过其它途径进一步代谢，导致副产物的生成。因此分批发酵生产L-亮氨酸的过程中，减弱EMP途径代谢流量，降低副产物HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸的生成以及控制TCA循环流量是提高L-亮氨酸得率的关键。

【发明内容】：本发明采用在培养基中添加一定量的柠檬酸或其盐的方法来减少黄色短杆菌生产L-亮氨酸过程中副产物HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸的生成。

柠檬酸或其盐能够抑制丙酮酸激酶活性，导致磷酸烯醇式丙酮酸积累，而磷酸烯醇式丙酮酸又会强烈抑制磷酸果糖激酶，同时柠檬酸可以通过加强ATP的抑制效应抑制磷酸果糖激酶的活力。由于丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途径的关键酶，所以发酵培养基中添加适量柠檬酸钠可以使得EMP途径代谢流量减弱，从而减少副产物的生成。另外发酵中后期菌体处于稳定期，HMP途径的主要作用是为L-亮氨酸合成途径的乙酰羟基酸还原异构酶催化的反应提供还原力NADPH，因此进入HMP途径的碳架最终在GAP节点重新进入EMP途径。HMP途径流量增加，从而还原力NADPH生成量增加，有利于L-亮氨酸的生成。适当控制TCA循环流量对于增加L-亮氨酸的合成是必要的。因为柠檬酸合成酶是TCA循环的限速酶，添加柠檬酸钠会竞争性抑制柠檬酸合成酶的活性。所以添加适量柠檬酸钠可以限制TCA代谢流量，减少碳架的浪费，从而提高乙酰辅酶A进入L-亮氨酸生物合成的代谢流，提高了L-亮氨酸的产量。

此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了发酵过程中副酸的减少和L-亮氨酸产量的提高，适合于工业化生产。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的一种减少L-亮氨酸发酵过程中副酸的方法，其特征是：在发酵培养基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度均为0.01～16g/L，优选0.05～10g/L，更优选0.1～5g/L。其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。

本发明根据调整代谢流分配的原理提出了减少黄色短杆菌生产L-亮氨酸过程中副产物HAc、L-缬氨酸和L-丙氨酸的生成的方法，在发酵培养基中添加适量柠檬酸钠可以抑制EMP途径关键酶丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，使得EMP途径代谢流量减弱，从而减少副产物的生成。

【具体实施方式】：

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范围：

实施例1：

采用的菌株为黄色短杆菌；

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，玉米浆10mL，豆饼水解液20mL，尿素2.0，KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄ 0.4，MnSO₄ 0.01，Met 0.4，VB₁ 300μg，VH 200μg。pH 7.0～7.2，0.075MPa，20min

发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，玉米浆43.5mL，NH₄Ac 16.7，(NH₄)₂SO₄17，KH₂PO₄ 1.25，MgSO₄ 0.5，MnSO₄ 0.01，FeSO₄ 0.01，Met 0.7，Glu 0.42，Ile 0.06，VB₁ 160μg，VH 50μg，CaCO₃ 20(分消)，pH 7.0～7.2，0.075MPa，20min