[发明专利]一种高效发酵生产L-异亮氨酸的方法

说明书

【技术领域】：本发明涉及一种高效发酵生产L-异亮氨酸的方法，属于发酵法生产氨基酸的技术领域。

【背景技术】：L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种分支链氨基酸之一，能治疗神经障碍、食欲减退和贫血，在人类生命代谢中占有特别重要的地位。但由于目前L-异亮氨酸价格昂贵，因此主要用于配制复合氨基酸制剂，特别应用于高支链氨基酸输液(如3H输液等)及口服液(肝安干糖浆等)。故而，异亮氨酸在医药、食品方面都有着广泛的应用。目前国际上日本在生产L-异亮氨酸方面占垄断地位，合计年产量400-500吨。鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸，国际市场医药级价格高达60-80美元/kg。国内由于菌种产酸性能差、工艺落后，L-异亮氨酸产量低，绝大部分依靠进口，尤其是医药级异亮氨酸，每年消耗大量外汇。与日本相比较，我国的L-异亮氨酸生产水平还很低下，而且异亮氨酸的生产能力与我国巨大的市场需求也很不相称。异亮氨酸发酵是典型的代谢控制发酵，L-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，但目前在工业生产上实施的只有发酵法。由于化学合成法生产的L-异亮氨酸与其它异构体分离困难，因而未能实现工业化生产。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-异亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。目前，异亮氨酸发酵的生产技术还不成熟。人们都在为提高异亮氨酸产量和转化率方面做努力，主要集中在基因工程手段定向选育异亮氨酸高产菌株、发酵过程控制与优化等方面。

在异亮氨酸发酵过程中，发酵条件如生物素、碳源、氮源、无机盐、pH、温度及溶氧等对异亮氨酸的合成都具有重要影响。其中，底物(如葡萄糖)浓度是控制菌体代谢过程的一个重要参数，主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径。葡萄糖可通过“葡萄糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解代谢物引起的。在以葡萄糖为碳源的异亮氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种副产物如乳酸的积累，从而影响糖酸转化率。此外，溶氧也是一个至关重要的因素，杂酸的产生和碳架的浪费与溶解氧浓度密切相关。因此在发酵过程中必须控制合适溶氧，以改变代谢流分布，增大L-异亮氨酸产率，减少杂酸的生成。

目前，我国异亮氨酸发酵行业主要采用补料分批发酵模式。在这种生产模式中，维持一定的底物(如葡萄糖)浓度对于异亮氨酸的发酵非常重要。为达到经济技术的要求，要提高单批次发酵过程中的谷氨酸产量就要提高初始培养基中的底物(如葡萄糖)浓度，但底物(如葡萄糖)浓度过高引起渗透压过大，影响菌体的正常代谢及异亮氨酸的产量。反之，初始葡萄糖浓度较低有利于菌体的生长，但后期发酵液中的残糖迅速耗尽，其生产能力不能得到最大限度的发挥。与此同时，在目前的生产模式中，溶氧浓度往往不能得到很好的控制，不是供氧不足就是供氧过量，而且溶氧水平浮动很大，不能长时间稳定的维持在一个恰当的水平上。在溶氧过低的条件下，TCA循环代谢流量减小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，从而刺激了乳酸脱氢酶的酶活，使代谢流转向乳酸生成，造成乳酸积累；而溶氧过高时，TCA循环流量加大，生成大量CO₂，造成碳源损失，两种情况均不利于异亮氨酸生成。此外，现有的很多L-异亮氨酸发酵培养基配方都不能很好的最大限度去满足其相应生产菌株的生长代谢和产酸要求。

【发明内容】：本发明的目的在于克服现有的异亮氨酸生产方法发酵产酸量较低、糖酸转化率低等缺陷，提供一种高效发酵生产L-异亮氨酸的方法。在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和L-异亮氨酸产量和转化率的提高。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的一种高效发酵生产L-异亮氨酸的方法，包括种子培养和进行好氧发酵，其特征是：发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平上，使整个发酵过程既不产生较多乳酸，也不导致由于TCA循环流量加大生成大量CO₂而造成碳源大量流失，通过流加液氨控制pH，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在一定水平，使整个发酵过程中既不产生葡萄糖抑制，也不构成底物限制，发酵至60h停止。

该方法的具体步骤如下：