[发明专利]优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法

权利要求书

1.一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，步骤如下：

(1)莱茵衣藻培养：

A、选细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849；

B、培养莱茵衣藻藻种：

(a)正常培养条件：温度25±1℃；日光灯光照强度100～200微摩尔光量子/平方米·秒；50～100ml TAP培养基液体培养，初始pH7.2，水平摇床转速100～130rpm，每5～6天1％接种继代培养；

(b)固体平板TAP培养基：琼脂粉1.5％；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每3周继代一次；

C、产氢培养条件：在缺硫培养基中进行，把TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装在培养瓶内，培养瓶上方留10ml的空间，橡皮塞密闭；黑暗条件下培养24小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50～100微摩尔光量子/平方米·秒，温度25±1℃；每24小时进行气体成分和含量检测一次；

D、气相色谱仪测定氢气和氧气含量：分子筛5×1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50℃，进样温度200℃，热导检测温度300℃；

(2)豆血红蛋白hemHc基因和lbac基因的密码子优化和合成：

A、从GenBank中调取序列号为M92427的慢生大豆根瘤菌hemH基因序列和序列号为V00453的大豆lba基因序列；

B、将豆血红蛋白hemH基因和lba基因的密码子对应的DNA核苷酸序列中第三位碱基对应的DNA核苷酸序列中的鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)改为腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)；将优化后的基因命名为hemHc和lbac；分别在hemHc基因的5’端和3’端加上限制性内切酶SacII的酶切位点序列；在lbac基因的5’端和3’端加上限制性内切酶Sma I和Sac I的酶切位点序列；

C、将优化后的hemHc基因和lbac基因的核苷酸序列以及添加的相应的限制性内切酶酶切位点核苷酸序列进行核苷酸序列合成；

(3)hemHc基因和lbac基因的扩增：

A、以步骤(2)C合成的hemHc基因和lbac基因核苷酸序列为模板，进行聚合酶链式反应，分别扩增hemHc基因和lbac基因；反应条件：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s，hemHc基因58℃，lbac基因59℃；退火30s，72℃延伸1.5min；30个循环；72℃延伸15min；反应产物分别纯化回收，用于测序鉴定和下一步莱茵衣藻叶绿体转化载体的构建；

B、PCR扩增、测序鉴定以及hemHc基因和lbac基因转录表达检测的特异性引物：

hemHc基因的特异性引物为：

hemHc-P1：5’-atgtcaacagcagctccaaatgaa-3’，斜体表示SacII酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

hemHc-P2：5’-tatatccaaccttgaagttcacgta-3’，斜体表示SacII酶切位点序列；

lbac基因的特异性引物为：

Lbac-P1：5’-c ttatgcttttttaatagctgctgc-3’，斜体表示SmaI酶切位点序列，方框中的序列是加入的增强翻译能力的RBS序列；

Lbac-P2：5’-tcc atggttgcttttactgaaaaacaa-3’，斜体表示SacI酶切位点序列；

(4)莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：

A、将步骤(3)PCR扩增并纯化回收的hemHc基因片段和lbac基因片段分别用限制性内切酶SacII酶切和用SmaI和SacI酶切；将纯化的lbac基因片段通过上述酶切位点用T4DNA连接酶连接质粒cg401-1中的aadA基因之后，形成aadA-lbac融合基因，得到载体cg401-1-lbac；用SacII酶切位点将hemHc基因用T4DNA连接酶连入到质粒cg401-1-lbac中aadA基因之后和lbac基因之前，形成aadA-hemHc-lbac融合蛋白，构建得到衣藻叶绿体表达载体cg401-1-hemHc-lbac；转化大肠杆菌DH5α，用于保存、鉴定和大量制备质粒DNA；

(4)莱茵衣藻叶绿体的转化：

A、取100ml对数期中后期的莱茵衣藻，25℃，3000rpm离心5min收集藻细胞，用新鲜TAP洗三次，涂于新鲜TAP固体平板上；光照100微摩尔光量子/平方米·秒，25土1℃条件下培养24小时；基因抢轰击转化；真空度9.48192×10⁴Pa，轰击距离9cm，氦气压力7.584236×10⁶Pa，金粉子弹经限制性内切酶EcoRI酶切质粒cg401-1-hemHc-lbac DNA包裹，金粉子弹颗粒直径1.0微米；

B、转化后的衣藻在光照和25±1℃条件下，过渡培养18h，用TAP液体培养基冲洗，涂布于含壮观霉素100μg/ml的TAP固体选择培养基上，25±1℃，100微摩尔光量子/平方米·秒连续光照，培养约7～15天；取有抗性的单藻落分别在选择培养基上多次继代培养；分别进行产氢培养，并检测产氢量和耗氧量；

(5)分析转基因莱茵衣藻中hemHc-lbac基因的整合及其表达：

A、hemHc lbac基因整合到莱茵衣藻叶绿体DNA的检测：

a、hemHc基因和lbac基因同源重组交换整合到莱茵衣藻叶绿体DNA，以转基因衣藻总DNA为模板的PCR产物为5254bp；未整合的PCR产物是3732bp；与莱茵衣藻叶绿体DNA结合的引物是cpDNA-P1：5’

-aacatgctaagtttacaagcccgaag-3’；cpDNA-P2：5’

-gtctttatgagccgtccccgaag-3’；

b、取对数生长后期的衣藻培养液，4℃低速离心收集，加350μl DNA提取液0.1mol/L氯化钠，50mmol/L乙二胺四乙酸，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0，，重悬沉淀；加入25μl 10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％十二烷基硫酸钠，混匀37℃水浴12小时，冰上冷却；加入200μl 5mol/L醋酸钾，静置离心；上清液中加入等体积25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，总DNA用无水乙醇沉淀和70％乙醇洗涤，干燥后溶于30μl三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液；

B、转基因莱茵衣藻中hemHc基因和lbac基因转录的检测：

取对数生长期中期的莱茵衣藻，室温3000rpm离心5分钟收集藻细胞，提取总RNA，反转录cDNA；利用hemHc基因和lbac基因的特异性引物和扩增hemHc基因和lbac基因所述的PCR条件扩增，进行hemHc基因和lbac基因转录水平的检测；

C、转基因莱茵衣藻中重组蛋白hemH和Lba表达量的检测：

a、按下列配比制备蛋白提取缓冲液：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH 8.3含1％曲拉通；上样缓冲液：0.25M三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸钠；0.25mg ml^-1溴酚兰；12.5％β-巯基乙醇；

b、取产氢培养的莱茵衣藻培养液，室温，3000rpm离心5min收集藻细胞，用250μl蛋白提取缓冲液悬浮，加入2μl β-巯基乙醇，液氮冻融三次；4℃条件下离心20min；取200μl蛋白上清液加入100μl上样缓冲液，用10％的分离胶和5％的浓缩胶进行凝胶电泳，转聚偏氟乙烯膜；分别用抗hemH多克隆抗体和抗Lba多克隆抗体做免疫杂交检测，再对HRP标记的抗体进行化学发光检测；

(6)分析重组豆血红蛋白hemH-Lba对莱茵衣藻生长的影响：

A、双光束紫外可见光分光光度计检测莱茵衣藻在750nm处的吸光度；

B、取藻液3000rpm离心5min收集藻细胞，加入同体积的95％乙醇溶液，混合均匀，室温避光放置20min，4℃，12000rpm离心10min；取上清，测定665纳米吸光度值及649纳米吸光度值的吸光值；

C、计算总叶绿素的含量，单位mg/L：

叶绿素Chl mg/L＝20.04×OD₆₄₉+6.10×OD₆₆₅；

(7)分析重组豆血红蛋白hemH-Lba对莱茵衣藻产氢培养的耗氧量和产氢量的影响：

A、黑暗呼吸耗氧和缺硫培养基中耗氧量以及产氢量的检测：

B、快速充氩气耗氧和缺硫培养基中产氢量的检测。

2.根据权利要求1所述的优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法，其特征在于：TAP培养基为三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐培养基。