[发明专利]优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及外源基因表达和生物制氢技术，具体地说是一种优化密码子提高外源基因表达量和莱茵衣藻制氢量的方法。

背景技术

光合生物制氢是未来清洁能源的重要来源之一，包括莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在内的许多微型绿藻和蓝藻可以在缺氧的条件下诱导细胞内的氢酶(H₂ase)基因表达，将光合作用中产生的H⁺和e^-合成H₂，释放到细胞外。这项技术是利用太阳能生产氢气的理想模式：莱茵衣藻生长速度快，培养成本低，氢酶活性高，是极有开发潜力的微藻光合制氢藻种。但是，氢酶对氧气极其敏感，很容易受氧气的抑制而失去活性，而氧气又是衣藻光合作用的主要产物，这一对矛盾限制了衣藻产氢技术的应用。为了提高衣藻光合产氢的效率，需要尽可能的降低衣藻细胞内的氧气含量或者提高氢化酶的氧耐受性。

豆科植物根瘤中的固氮酶与氢酶有相似的特性，也对氧气敏感，但是根瘤中的固氮酶却有很高的固氮活性，这与根瘤细胞中含有大量的豆血红蛋白leghemoglobin，简称Lb，有着密切的关系。豆血红蛋白有两个亚基构成，一个是球蛋白亚基，由豆科植物合成；另一个是血红素辅基，由共生的根瘤菌合成，两个亚基结合成为有活性的豆血红蛋白。豆血红蛋白具有与氧气可逆结合、降低细胞内氧浓度和调节呼吸作用的特性，既能维持根瘤细胞内较低的氧气含量，又能保障呼吸作用需氧和固氮需要的能量。中国专利200380107352.7和02138702.8分别公开了利用表达豆血红蛋白改变植物贮藏储备物含量和提高植物抗涝能力。生物发酵工程的已有技术中也有应用其它血红蛋白体外重组表达而使产量提高的报导。

在植物细胞内，尤其是叶绿体中，存在着血红素辅基合成的前体，即可以通过叶绿素合成途径的原扑啉在根瘤菌(Bradyrhizobium Japonicum)亚铁螯合酶(ferrochelatase)催化下合成血红素辅基(Sangwan和O’Brain，1991；Santana等，1998)。本发明人曾将大豆血红蛋白球蛋白亚基lba基因转入莱茵衣藻叶绿体中表达使转基因莱茵衣藻产氢量提高了50％(中国发明专利申请号201010107922.4)；将根瘤菌亚铁螯合酶基因hemH与lba基因共同转入莱茵衣藻叶绿体中表达使转基因莱茵衣藻产氢量提高了4倍(中国发明专利申请号201010115015.4)。

莱茵衣藻叶绿体基因表达的密码子具有明显的腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)偏向性(Nakamura et al.，2000)，2002年，Franklin等在莱茵衣藻叶绿体中成功表达了密码子优化的绿色荧光蛋白基因GFP基因，表达量提高了80倍。随后在2003年和2004年Mayfield等将密码子优化后的报告基因luxCt转入莱茵衣藻叶绿体，该基因得到了成功表达并具有活性。1991年Goldschmidt-Clermont构建的aadA基因表达原件之所以能用于莱茵衣藻叶绿体转化筛选的标签是因为z在构建时考虑了它的密码子偏向性与衣藻叶绿体中密码子的偏向性一致。Franklin和Mayfield 2004年指出莱茵衣藻的核基因组也具有密码子的偏向性。2004年，Gustafsson等提出其它的一些生物体包括原核(Dos和Wernisch，2003)和真核生物(Kanaya等，2001)也具有密码子的偏向性。2005年，Liu等指出在高等植物中也存在密码子的偏向性，同年Lavner和Kotlar指出人类基因组也存在密码子的偏向性。因此，除了启动子、内含子和5’UTRs和3’UTRs之外，在外源基因的表达中密码子偏向性也是一个重要的调控因子。

因此发明一种利用密码偏向性进行密码子优化，并将优化后的hemHc基因和lbac基因转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，提高豆血红蛋白基因表达量和莱茵衣藻产氢量的方法是十分重要的。

本发明首次对豆血红蛋白亚铁螯合酶基因hemH和大豆血红蛋白球蛋白亚基基因lba按照衣藻叶绿体基因表达的A、U密码偏向性进行密码子优化，并将优化后的hemHc基因和lbac基因转入莱茵衣藻的叶绿体内表达，结果使重组蛋白hemH和Lba的表达量提高了6.8倍，使转基因莱茵衣藻的产氢量进一步提高了22％。本发明方法解决了外源基因在莱茵衣藻叶绿体中表达量低的技术难题，具有实用性，而且为进一步利用豆血红蛋白特性提高衣藻产氢的生物工程技术提供理论和实验基础。随着生物制氢技术的发展，本发明将显现出越来越大的实用性和重要性。

发明内容