[发明专利]一种用百草枯筛选转基因植物的方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因植物技术领域，具体而言，本发明涉及用于百草枯抗性的转基因植物的规模化筛选的双蛋白表达的表达盒以及基于该表达盒的载体、规模化筛选百草枯抗性的转基因植物和规模化筛选百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的转基因植物的方法。

背景技术

转基因技术是现代生物技术的核心，利用转基因技术生产优质、多抗、高效、多产的作物新品种，是缓解资源束缚、保护环境安全以及拓展农业功能的重要途径。发展和完善现有转基因技术具有重要的实际应用价值。在实际基因转化操作过程中，只有小部分的植物细胞能够吸收外源DNA并整合到植物基因组上，仍有大部分植物细胞处于未转化状态，为了从数目庞大的植物细胞中筛选得到外源DNA整合的植物细胞，需要筛选标记基因的辅助。现在常用的筛选标记基因主要有抗生素类和除草剂两类。

抗生素抗性基因因具有高转化效率和方便筛选等优点而成为最常用的筛选标记。但是人们担心抗生素抗性基因会转移到微生物中，使病原菌带有抗生素抗性从而导致临床上抗生素使用失效。另一方面，抗生素的价格昂贵，作为筛选标记成本高。因此，抗生素抗性基因作为筛选标记多用于科学研究过程中。除草剂抗性基因是近几年来发展起来的一种新型的筛选标记与抗生素抗性基因相比，除草剂抗性基因具有价格低的优点，也不会产生临床抗生素失效等担忧，同时除草剂抗性基因不仅是筛选标记基因还是一种目的基因，能使转基因作物具有良好的除草剂抗性性状。现在主要使用的除草剂抗性基因有草甘膦抗性基因和草丁膦抗性基因等，因草丁膦价格相对较高使得草丁膦抗性基因作为筛选标记基因主要用于实验室研究。草甘膦抗性基因是应用比较多的一种筛选标记基因。虽然除草剂抗性基因是产业化转基因筛选的优良选择标记基因，但是其尚未得到大规模的应用。这主要由除草剂抗性基因单一造成的，目前大多数的除草剂抗性基因是草甘膦抗性基因，是在已有的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基因的基础上修饰得到的，新型的除草剂抗性基因的研究一直没有显著进展。研发一种新型的除草剂抗性基因是一项工作量巨大而且具有很大不确定性的工作。

百草枯(paraquat，1，1-二甲基-4，4’-联吡啶，分子量257.2)是继草甘磷之后的第二大除草剂，是一种速效触杀型除草剂，兼有一定内吸作用，主要用于果园、桑园、茶园、林带等作物的杂草，在农业种植中的广泛应用已近50年，应用在世界范围内超过100个国家，受到广泛接受与欢迎。百草枯是非选择性除草剂，植物对其吸收非常迅速，即使喷药后短期内降雨也不影响药效的发挥。百草枯具有接受广泛、广谱性、药效明显、价格低等优点，将是一种优良的植物转基因筛选剂，但是由于百草枯抗性基因的研究一直以来没有突破性的进展，使得百草枯作为筛选剂也仅仅停留在实验预想阶段。

本发明人通过漫长而艰苦的筛选实验，构建出一种双蛋白表达盒，这种双蛋白表达盒中所选取的具体调控序列及其组合，尽管是顺序表达，但是我们发现，后一个表达盒也能高效表达，可以满足同时有效表达两个蛋白的需要。根据本发明人选用的颜色辨识基因，大大方便了规模化筛选百草枯抗性基因的过程，并最终筛选得到了一个百草枯抗性基因。在此基础上，本发明人还发明了一种利用百草枯筛选转基因植物的新方法，同时获得具有百草枯抗性和非百草枯抗性的另一抗性的转基因植物，也方便了规模化筛选，同时排除了已经被要求或潜在将被要求不能出现在产业应用的抗抗生素基因的使用，具有很大的实际应用价值和市场推广前景。

发明内容

本发明提供了用于百草枯抗性的转基因植物的规模化筛选的双蛋白表达的表达盒以及基于该表达盒的载体、规模化筛选百草枯抗性的转基因植物和规模化筛选百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的转基因植物的方法。这些产品和方法大大方便了筛选操作，从而可以规模化应用，并且可以满足同时有效表达两个蛋白的需要，尤其是在顺序表达时后一个表达盒也能高效表达；这些产品和方法还可以排除已经被要求或潜在将被要求不能出现在产业应用的抗生素基因的使用。另外，本发明还涉及各种中间产物，如检测引物对，用于检测转基因植物中的异源蛋白。