[发明专利]一种黄牛ADD1基因单核苷酸多态性及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及黄牛ADD1基因的单核苷酸多态性(SNP)的筛查和检测及其作为辅助选择标记在黄牛育种中的应用。

背景技术

基因多态性是指不同物种或同一物种内不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，它包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

单核苷酸多态性指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种：一种是同义基因多态性，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义基因多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90％可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。

Adducin是一种新的细胞膜骨架蛋白，是一种由α和β两个亚单位组成的异二聚体蛋白质(hetero dimeric protein)，位于spectrin-actin的连接部。Adducin可选择性地与spectrin-actin复合物结合，结合位点位于其α和β亚单位的尾部，且亲和力明显高于与任一spectrin或actin单体的结合(J Biol Chem，1996)。电镜证实，adducin还具有促进spectrin分子与spectrin-actin复合物结合而形成多边网状结构，以及促进actin纤维聚合的功能(J Biol Chem，1998)。1996年Kuhlman等发现adducin尚具有阻止actin纤维快速生长端(fast growing end)延伸的功能，起成帽蛋白的作用，其结果使actin纤维长度均一，更有利于actin纤维的聚合。Actin(肌动蛋白)是一种重要的收缩蛋白，不仅参与肌球蛋白介导的肌肉收缩运动(Holmes，1998；Pollard，1990)，而且也可以通过受调控的聚合动力学过程(Smith，1988)或凝胶一溶液转化(Pollard et al.，1982)单独介导细胞运动。Adducin除具有构建和维持细胞膜骨架网状结构的功能外，在细胞信号转导和细胞膜离子转运中亦有重要作用。Tripodi等于1996年进行的大鼠肾小管上皮细胞(NRK252E)转染试验进一步证实，与转染MNScDNA的细胞相比，携带突变cDNA的转染细胞钠泵的最大转运速率加快，且actin与突变adducin的聚合作用明显增强，提示adducin基因突变具有显著的功能改变。Adducin参与小鼠卵母细胞染色体的减数分裂，提示其在胚胎发育中可能起一定作用。在猪上的研究表明，编码肌动蛋白(Actin)的基因与皮率、肩部背膘厚、肥肉率、瘦肉率、臀部平均背膘厚、眼肌高、股二头肌pH和肌内脂肪有一定的相关性。

目前，对ADD1基因的研究着重在人和小鼠上，且是与高血压发病的关系的研究。但是对有关ADD1基因变异与高血压发病关系的研究结果颇不一致。关于ADD1基因与生长发育性状的研究尚未有报道，基于肌动蛋白的研究成果，将进一步探讨adducin(细胞膜骨架蛋白)的功能。

发明内容