[发明专利]一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法

权利要求书

1.一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，包括：

(1)细菌纤维素小球的制备

将活化的斜面菌种接入pH4.8～5.2的种子培养基，在25～30℃、100～200rpm条件下培养12～16h制得液体种子，以体积百分比为4～10％接种量将液体种子转接至pH4.8～5.2的发酵培养基中，每500mL锥形瓶中含有200～300mL发酵培养液，25～30℃，80～200rpm条件下培养48～96h，倾滤，得细菌纤维素小球；

(2)细菌纤维素小球的处理

将发酵收集得到的细菌纤维素小球用质量分数为0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min，用去离子水漂洗3～5次，收集，用体积分数为0.1％的醋酸中和小球内残留的碱液，静置12～24h，用去离子水漂洗2～3次，在水中保持其球状形态，将小球取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥后获得白色纤维素小球；

(3)细菌纤维素小球固定化酶的制备

以细菌纤维素小球为载体采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。

2.根据权利要求1所述的一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)的菌种选自醋杆菌、木醋杆菌、产醋醋杆菌、醋化杆菌、许氏醋酸菌、恶臭醋酸菌、奥尔兰醋杆菌、弯醋杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、葡萄糖氧化杆菌、农杆菌、根瘤菌、洋葱假单胞菌、八叠球菌、椰毒假单胞菌、空肠弯曲菌中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的种子培养基，按重量百分比，包含：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.27％，柠檬酸0.115％。

4.根据权利要求1所述的一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵培养基，按重量百分比，包含：葡萄糖2.0％，酵母粉0.5％，胰蛋白胨0.3％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.27％，柠檬酸0.115％。

5.根据权利要求1所述的一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中物理吸附法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素小球0.05～0.4g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附6～24h，取出细菌纤维素小球，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存。

6.根据权利要求1所述的一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中吸附～交联法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素小球0.05～0.4g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附6～24h，以1g纤维素小球：25～200mL戊二醛溶液的比例加入质量体积百分比为25％的戊二醛溶液，20～30℃搅拌条件下交联反应1～3h，取出细菌纤维素小球，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干小球表面水分，4℃冰箱保存。

7.一种以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的方法，包括

(1)将细菌纤维素膜用质量分数为0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min至膜呈乳白色半透明，用去离子水漂洗3-5次，收集，用体积分数为0.1％的醋酸中和膜内残留的碱液，静置12～24h，用去离子水漂洗2-3次，滤纸吸干膜表面水分，将膜切成膜块，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥，备用；或将去离子水漂洗的膜在冷冻干燥机中冻干后，将冻干后的膜切成膜块，备用；

(2)固定化酶的制备

以细菌纤维素膜块为载体采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。

8.根据权利要求7所述的一种以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中物理吸附法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素膜块0.002～0.5g并使其浸没，轻微振荡3～5min，在4℃条件下吸附0.5～24h，取出细菌纤维素膜块，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存。

9.根据权利要求7所述的一种以细菌纤维素膜块为载体制备固定化酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中吸附～交联法，包括：5～10ml的100～5000U/L酶液中加入细菌纤维素膜块0.002～0.5g并使其浸没，轻微振荡3-5min，在4℃条件下吸附0.5-24h，以1g纤维素膜：25～200mL戊二醛溶液的比例加入质量体积百分比为25％的戊二醛溶液5-15mL，20-30℃条件下交联反应1-3h，取出细菌纤维素膜块，用缓冲溶液漂洗1～2次，吸干膜块表面水分，4℃冰箱保存。