[发明专利]一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法

说明书

技术领域

本发明属固定化酶技术领域，特别是涉及一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法。

背景技术

由于酶具有较好的底物专一性，在许多领域具有重要应用价值。但游离的酶蛋白在实际应用过程中易受环境条件影响而变性失活，且不易从反应体系中分离以实现重复使用的目的，这在一定程度上限制了酶的工业化应用。酶固定化技术是实现酶重复连续使用和改善其稳定性的有效手段。目前酶的固定化载体主要包括无机载体材料(如二氧化硅、活性炭、多孔性玻璃等)、有机合成高分子材料(如聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯等)和天然高分子材料(如结构性蛋白，壳聚糖，海藻酸钠等)，但尚无利用细菌纤维素小球为载体来固定化酶的报道。现有的固定化酶技术主要有5种：(1)微囊法：该法是利用半透膜能阻止大分子的酶从胶囊中扩散出去，而小分子反应物和产物能自由扩散的特性来实现的；(2)惰性载体吸附法：酶可以通过范德华力，氢键，疏水作用，静电相互作用等吸附到不溶性支持物上，从而达到固定化的目的；(3)共价交联法：利用双功能试剂可以使分子与分子交联起来而形成大分子颗粒，从而实现酶的固定化；(4)胶格物理包埋法：该包埋是通过成胶物质在酶的水溶液中聚合而实现的，最常用的是聚丙烯酰胺胶，其它还有淀粉胶等；(5)与水不溶性载体共价结合法：根据酶和载体本身的理化性质，通过共价偶联使酶和载体产生共价结合。

细菌纤维素(bacterial cellulose，BC)是一种由微生物合成的高纯度胞外生物纤维。细菌纤维素的初级结构与植物纤维素相似，由吡喃葡萄糖单体以β-1，4糖苷键连接而成的直链多糖，但是BC的纤维结构却与植物纤维大不相同。BC由微纤维丝组成，这种微纤维丝呈带状，其厚度为0.1μm左右，比植物纤维的厚度(10μm)小两个数量级。此外，这种微纤维丝具有明显的网状结构。由于BC微结构的特性，它具有许多独特的性质，例如良好的机械强度，超细纳米纤维网络，生物可降解性，较大的比表面积、导电性和高的结晶度等特性。近几年，有研究报道利用化学改性后的细菌纤维素膜为载体用于微生物细胞的固定化，其固定化后的微生物细胞对孔雀石绿染料的降解效果良好，在培养液初始pH值和染料初始浓度不变的情况下仍能保持稳定的脱色率。细菌纤维素作为一种新型的纳米纤维生物材料，已经成为国内外研究的热点。细菌纤维素具有纳米纤维网络结构，因此该纤维材料具有非常高的比表面和数量众多的空隙结构，有利于吸附和包容酶蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以细菌纤维素小球/膜块为载体制备固定化酶的方法，具有工艺简便，可操作性强，酶活损失小等优点。

本发明提供一种以球形细菌纤维素为载体制备固定化酶的方法，包括：

(1)细菌纤维素小球的制备

将活化的斜面菌种接入pH4.8～5.2的种子培养基，在25～30℃、100～200rpm条件下培养12～16h制得液体种子，以体积百分比为4～10％接种量将液体种子转接至pH4.8～5.2的发酵培养基中，每500mL锥形瓶中含有200～300mL发酵培养液，25～30℃，80～200rpm条件下培养48～96h，倾滤，得细菌纤维素小球；

(2)细菌纤维素小球的处理

将发酵收集得到的细菌纤维素小球用质量分数为0.1％的NaOH在80～90℃水浴中处理30～120min，用去离子水漂洗3～5次，收集，用体积分数为0.1％的醋酸中和小球内残留的碱液，静置12～24h，用去离子水漂洗2～3次，在水中保持其球状形态，将小球取出，吸干表面水分，在液氮中速冻或在低温冰箱里冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥后获得白色纤维素小球；

(3)细菌纤维素小球固定化酶的制备

以细菌纤维素小球为载体采用物理吸附法或吸附～交联法制备固定化酶。