[发明专利]同时检测马铃薯甲虫AChE基因和Na+通道基因突变的引物及PASA方法

权利要求书

1.一对用于扩增马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶基因的外引物，其特征在于该外引物的等位基因非特异性正向引物序列为SEQ ID NO：1，等位基因非特异性反向引物序列为SEQ ID NO：2。

2.一种可同时检测马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶基因S291G突变和Na⁺通道基因L1014F突变的PASA方法，其特征在于该方法包含以下几个步骤：

a、按常规方法提取马铃薯甲虫基因组DNA；

b、采用以下特异性和非特异性引物对步骤a中提取的马铃薯甲虫的基因组DNA进行PCR扩增：

乙酰胆碱酯酶基因

外引物

AF：SEQ ID NO：1

AR：SEQ ID NO：2

内引物

ARF：SEQ ID NO：3

ASR：SEQ ID NO：4

Na⁺通道基因

外引物

NF：SEQ ID NO：5

NR：SEQ ID NO：6

内引物

NRF：SEQ ID NO：7

NSR：SEQ ID NO：8；

c、琼脂糖凝胶电泳并根据电泳结果判断马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶基因S291G突变和Na⁺通道基因L1014F突变的情况。

3.根据权利要求2所述的可同时检测马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶基因S291G突变和Na⁺通道基因L1014F突变的PASA方法，其特征在于所述的步骤b中对马铃薯甲虫的基因组DNA进行PCR扩增时，PCR反应体系中各组分的体积百分数为：10％10×PCR Buffer、8％Mg²⁺(25mM)、4％单头马铃薯甲虫成虫基因组DNA、8％dNTPs(2.5mM)、10μM引物ARF和ASR各2％，其它10μM引物各4％、1％TaqE(5U/μl)，加双蒸水至反应总体积为100％；

PCR扩增程序：94℃变性4分钟；进入循环，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分钟，16个循环；94℃变性30秒，57℃退火30秒，每循环降0.5℃，72℃延伸1分钟，2个循环；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，15个循环；94℃变性30秒，56℃退火30秒，每循环降0.5℃，72℃延伸1分钟，2个循环；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，9个循环；最后72℃延伸7分钟。

4.根据权利要求2所述的可同时检测马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶基因S291G突变和Na⁺通道基因L1014F突变的PASA方法，其特征在于所述的步骤c中如果扩增得到6条带：片段为720bp，299bp、456bp及273bp，177bp和100bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G及L1014F等位基因抗性杂合子RS；

如果扩增得到5条带：片段为720bp，299bp、456bp及273bp和177bp，表明该马铃薯甲虫S291G等位基因抗性杂合子RS，L1014F等位基因抗性纯合子RR；如果扩增的片段为720bp，299bp、456bp及273bp和100bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G等位基因抗性杂合子RS，L1014F等位基因敏感纯合子SS；片段为720bp和299bp及273bp，177bp和100bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G等位基因抗性纯合子RR，L1014F等位基因抗性杂合子RS；片段为720bp和456bp及273bp，177bp和100bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G等位基因敏感纯合子SS，L1014F等位基因抗性杂合子RS；

如果扩增得到4条带：片段为720bp，299bp、及273bp和100bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G等位基因抗性纯合子RR，L1014F等位基因敏感纯合子SS；片段为720bp，456bp、及273bp和177bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G等位基因敏感纯合子SS，L1014F等位基因抗性纯合子RR；片段为720bp，299bp、及273bp和177bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G及L1014F等位基因抗性纯合子RR；片段为720bp，456bp、及273bp和100bp，表明该马铃薯甲虫个体为S291G及L1014F等位基因敏感纯合子SS。