[发明专利]同时检测马铃薯甲虫AChE基因和Na+通道基因突变的引物及PASA方法有效

专利信息
申请号: 201010533079.6 申请日: 2010-11-05
公开(公告)号: CN101974518A 公开(公告)日: 2011-02-16
发明(设计)人: 姜卫华;郭文超;卢伟平;熊满辉;王志田;李国清 申请(专利权)人: 南京农业大学
主分类号: C12N15/11 分类号: C12N15/11;C12Q1/68
代理公司: 南京天华专利代理有限责任公司 32218 代理人: 徐冬涛
地址: 210095 *** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 同时 检测 马铃薯 甲虫 ache 基因 na sup 通道 基因突变 引物 pasa 方法
【说明书】:

技术领域

发明属于生物技术领域,涉及一种同时检测马铃薯甲虫(Colorado potato beetle,Leptinotarsa decemlineata)乙酰胆碱酯酶(AChE)基因及Na+通道基因突变的PASA方法。专用于马铃薯甲虫发生疫区由于对有机磷、氨基甲酸酯及拟除虫菊酯药剂抗性而引起的靶标突变的高灵敏度快速检测,同时可用于田间马铃薯甲虫对这几类药剂抗性水平的早期诊断和监测。 

背景技术

我国的马铃薯种植区域非常广泛,一年四季都有种植,播种面积和总产量均居世界第一位,是我国主要粮菜兼用作物及第四大粮食作物(郭玉锋等,2010),马铃薯已经成为我国农业增产、农民增收的主导产业,但随着种植面积的扩大,病虫为害逐年加重,成为限制马铃薯高产、丰产的主要因素,严重影响了马铃薯产业发展(雷玉明等,2010)。其中马铃薯甲虫是是国际公认的毁灭性检疫害虫,也是我国对外重大检疫对象和重要外来入侵物种之一。马铃薯甲虫传入我国新疆后,近20年来自西向东传播,目前在新疆北部大部分区域均有分布,疫区面积扩大了数百倍。而且近几年马铃薯甲虫出现扩散加快和危害加重的趋势(郭文超等,2010)。 

目前化学防治仍然是控制马铃薯甲虫的主要途径,但过度、频繁以及单一的药剂使用,不可避免地造成马铃薯甲虫对多种药剂产生抗性(Jiang et al.,2010)。作者通过测定发现新疆大部分种群已对三氟氯氰菊酯和溴氰菊酯产生了中到极高水平抗性,对丁硫克百威、克百威和部分有机磷农药品种产生了低到高水平抗性。抗药性的产生无疑对马铃薯甲虫的防治带来了更多威胁和挑战。 

昆虫对杀虫剂产生抗性的生理生化机制,主要包括表皮穿透速率降低、解毒酶活性的升高、靶标不敏感性;而靶标不敏感性是最主要的抗性机制。国外研究已经阐明马铃薯甲虫对谷硫磷、克百威等有机磷、氨基甲酸酯类药剂的抗性机制与其靶标乙酰胆碱酯酶(AChE)基因S291G突变有关,对氯菊酯等菊酯的抗性与钠离子通道基因的L1014F突变有关(Zhu etal.,1995;Zhu et al.,1996;Lee et al.,1999)。 

抗性治理可以延缓和减低抗性进程,延长现有杀虫剂的使用寿命。而抗性治理有赖于抗 性动态监测和抗性机理的揭示。抗性监测是了解和掌握害虫对药剂的抗性水平及发展趋势的基础措施。抗性监测的方法主要包括生物测定法、生物化学分析法及分子生物学检测法。生物测定是经典可靠的方法,但其由于需虫量大,工作量大等限制因素,给监测工作带来了很大局限和困难。只有简单、便宜、有效,能区分SS、RR、RS基因型的抗性检测方法,才能改变传统生测法的抗性监测总是落后于抗性发展的被动状态,从而达到害虫控制目的,这对害虫抗性治理无疑具有非常重要的意义。 

我们近两年的抗性生物测定结果明确显示新疆马铃薯甲虫已对有机磷、氨基甲酸酯及拟除虫菊酯等常规常用类型药剂产生明显抗性,为了保护日益枯竭的农药资源,建立合理有效的抗性策略,抗性监测是必不可少的重要环节。一套能够快速准确检测新疆马铃薯甲虫抗性动态的技术的出台也是迫在眉睫。国外已有分别检测出马铃薯甲虫对氯菊酯以及克百威抗性靶标Na+通道及AChE靶标单点突变的相关的分子检测技术(Clark et al.,2001;Kim et al.,2005),但为了更快、更准确、更节省虫量,尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测方法,针对适用于我国新疆马铃薯甲虫抗性动态的分子检测及抗性机制的验证,从而可以将之投入到商业生产和应用中,在国外检测技术的基础上,我们设计建立了一套同时能检测出AChE点突变S291G及Na+通道点突变L1014F的PASA(PCR amplification of specificalleles,等位基因特异性扩增)检测方法,此方法灵敏特异又快速,可以为马铃薯甲虫对有机磷、氨基甲酸酯及拟除虫菊酯的抗性监测提供更好的选择。 

发明内容

针对背景技术中提出的现有技术中马铃薯甲虫抗性监测的生物学检测方法所需周期长、虫量大,工作量多的问题,以及现有技术中没有同时检测马铃薯甲虫AChE基因S291G突变和Na+通道基因L1014F突变PASA方法的技术问题。 

本发明的目的在于提供一对用于扩增马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶(AChE)基因的外引物。 

本发明的另一个目的在于提供一种可同时检测马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶(AChE)基因S291G突变和Na+通道基因L1014F突变的PASA方法。 

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